目的 探究长链非编码RNA（lncRNA） NNT-AS1对膀胱癌细胞增殖、转移及肿瘤干细胞干性的影响和机制。方法 qRT-PCR检测lncRNA NNT-AS1在膀胱癌细胞T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP和膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达，将T24细胞和膀胱癌干细胞分为sh-NC组（转染sh-NC）、sh-NNT-AS1组（转染sh-NNT-AS1）、Control组（共转染sh-NC、inh-NC和si-NC）、sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组（共转染sh-NNT-AS1、inh-NC和si-NC）、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组（共转染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和si-NC）、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组（共转染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和NCKAP1小干扰RNA）。CCK8检测各组细胞增殖能力；Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力；细胞成球实验检测各组干细胞干性；流式细胞术检测CD133和CD44表达；双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA NNT-AS1与miR-582-5p及miR-582-5p与NCKAP1的靶向关系；体内成瘤实验检测lncRNA NNT-AS1对体内成瘤的影响；Western blot检测NCKAP1、YAP、TAZ、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表达。结果 lncRNA NNT-AS1高表达于T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP细胞。与sh-NC组比较，sh-NNT-AS1组T24细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降（P<0.05），膀胱癌干细胞成球数、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表达及CD133+CD44+细胞比例显著减少（P<0.05）。lncRNA NNT-AS1调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴。与Control组比较，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组细胞光密度（OD）值显著降低（P<0.05），细胞迁移和侵袭数显著减少（P<0.05），膀胱癌干细胞干性显著降低（P<0.05），肿瘤体积显著减小（P<0.05），YAP和TAZ表达显著下调（P<0.05）。与sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组比较，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组细胞OD值、细胞迁移数和侵袭数均显著升高/增加（P<0.05），膀胱癌干细胞干性、肿瘤体积显著增加（P<0.05），YAP和TAZ表达均显著升高（P<0.05）。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组比较，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞OD值、细胞迁移数和侵袭数均显著降低/减少（P<0.05），膀胱癌干细胞干性、肿瘤体积显著减小（P<0.05），YAP和TAZ表达均显著降低（P<0.05）。结论 lncRNA NNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴影响膀胱癌细胞的增殖、转移及肿瘤干细胞干性，并激活Hippo-YAP/TAZ信号通路。