肿瘤细胞通过上调ATG4D表达增强自噬而抵抗失巢凋亡

马晓壮; 张越婷; 孙梁博; 闫小晶; 杨明珍; 连继勤

doi:10.16016/j.2097-0927.202602096

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肿瘤细胞通过上调ATG4D表达增强自噬而抵抗失巢凋亡

基础医学 | 更新时间：2026-07-15

- 肿瘤细胞通过上调ATG4D表达增强自噬而抵抗失巢凋亡
- Upregulation of ATG4D promotes anoikis resistance of tumor cells by autophagy enhancement
- 陆军军医大学学报 2026年48卷第13期页码：1854-1862
- 作者机构：
  
  陆军军医大学（第三军医大学）药学与检验医学系临床生物化学教研室，重庆
- 作者简介：
  
  连继勤，E-mail：lianjiqin@sina.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金面上项目(82273114);重庆市自然科学基金创新发展联合基金重点项目(CSTB2022NSCQ-LZX0018)
- DOI：10.16016/j.2097-0927.202602096
  中图分类号： R394.2;R73-37;R730.23
- 收稿：2026-02-27，
  
  修回：2026-05-12，
  
  录用：2026-05-17，
  
  纸质出版：2026-07-15
- 稿件说明：
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马晓壮，张越婷，孙梁博，等.肿瘤细胞通过上调ATG4D表达增强自噬而抵抗失巢凋亡［J］.陆军军医大学学报，2026，48（13）：1854-1862.DOI：10.16016/j.2097-0927.202602096.

MA X Z，ZHANG Y T，SUN L B，et al.Upregulation of ATG4D promotes anoikis resistance of tumor cells by autophagy enhancement［J］.J Army Med Univ，2026，48（13）：1854-1862.DOI：10.16016/j.2097-0927.202602096.
马晓壮，张越婷，孙梁博，等.肿瘤细胞通过上调ATG4D表达增强自噬而抵抗失巢凋亡［J］.陆军军医大学学报，2026，48（13）：1854-1862.DOI：10.16016/j.2097-0927.202602096. DOI：

MA X Z，ZHANG Y T，SUN L B，et al.Upregulation of ATG4D promotes anoikis resistance of tumor cells by autophagy enhancement［J］.J Army Med Univ，2026，48（13）：1854-1862.DOI：10.16016/j.2097-0927.202602096. DOI：

摘要

目的

失巢凋亡抵抗（anoikis resistance，AR）是转移性肿瘤细胞所具备的关键特征，而自噬水平增强则是引起AR的重要原因，自噬相关蛋白4D（autophagy related 4D，ATG4D）是调控细胞自噬的关键酶，本研究着重探讨肿瘤细胞是否通过上调ATG4D表达增强自噬而促进AR的作用及分子机制。

方法

将肝癌HepG2细胞和胃癌AGS细胞分为AR组和对照组。AR组用超低黏附细胞培养板悬浮培养48 h，对照组用常规细胞培养板贴壁培养。Western blotting检测自噬标志蛋白Ⅱ型微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3 Ⅱ， LC3-Ⅱ）与p62表达变化并进行定量分析。使用30 μg/mL氯喹（chloroquine，CQ）处理对照组或AR组肿瘤细胞抑制细胞自噬，然后使用凋亡检测试剂盒结合流式细胞术分析细胞凋亡水平变化。qRT-PCR结合Western blotting检测ATG4D的mRNA与蛋白水平变化。在AR肿瘤细胞中通过脂质体法转染对照siRNA或

ATG4D

siRNA，Western blotting检测ATG4D蛋白含量及自噬标志物LC3-Ⅱ与p62表达变化，使用凋亡检测试剂盒结合流式细胞术分析细胞凋亡水平变化。构建包含

ATG4D

基因启动子的报告质粒，将报告质粒分别转入对照组及AR组肿瘤细胞，24 h后使用荧光素酶报告基因实验检测

ATG4D

基因启动子活性变化。使用放线菌素D（5 μg/mL）处理对照组或AR组肿瘤细胞，分别于处理后0、2、4、6、8 h收取细胞，通过qRT-PCR检测

ATG4D

的mRNA在不同时间点水平变化。使用环乙酰亚胺（50 μg/mL）处理对照组或AR组肿瘤细胞，分别于处理后0、2、4、6、8 h收取细胞，通过Western blotting检测ATG4D蛋白在不同时间点水平变化。

结果

与对照组肿瘤细胞相比，AR组肿瘤细胞自噬水平显著增强，LC3-Ⅱ水平显著

升高（

0.01），p62水平明显降低（

0.01）。使用CQ抑制自噬后，AR+CQ处理组肿瘤细胞的凋亡水平显著增加（

0.01）。qRT-PCR及Western blotting检测发现，AR组肿瘤细胞中

ATG4D

mRNA与ATG4D蛋白水平较对照组均显著增强（

0.01）。使用

ATG4D

siRNA能够明显抑制

ATG4D

的表达，并下调LC3-Ⅱ表达水平、增强p62表达水平、促进AR肿瘤细胞凋亡（

0.01）。与对照组肿瘤细胞相比，AR组肿瘤细胞中

ATG4D

基因启动子活性并无明显改变。经放线菌素D处理后，AR组肿瘤细胞在各处理时间点

ATG4D

的mRNA表达量均显著升高（

0.001），表明

ATG4D

mRNA的稳定性在AR肿瘤细胞中显著增强。经环乙酰亚胺处理后，AR组肿瘤细胞在各处理时间点ATG4D 的蛋白表达量无显著变化，表明ATG4D蛋白的稳定性在AR肿瘤细胞中无明显变化。

结论

ATG4D表达上调引起的自噬水平增强促进肿瘤细胞的AR。

Abstract

Objective

Anoikis resistance (AR) is a critical characteristic of metastatic tumor cells

and enhanced autophagy is an important contributor to AR. Autophagy-related 4D (ATG4D) is a key enzyme regulating autophagy. This study aims to investigate whether tumor cells promote AR by upregulating ATG4D expression to enhance autophagy and elucidate the underlying molecular mechanisms.

Methods

Hepatocellular carcinoma HepG2 cells and gastric cancer AGS cells were divided into an AR group and a control group. The AR group was cultured in ultra-low adhesion plates for 48 h

while the control group was cultured in conventional plates. Changes in the expression of autophagy markers LC3-Ⅱ and p62 were determined by Western blotting. Chloroquine (CQ

30 μg/mL) was used to inhibit autophagy in control or AR tumor cells

followed by flow cytometry for apoptosis levels with an apoptosis detection kit. The expression of ATG4D at mRNA and protein levels were assessed by qRT-PCR and Western blotting

respectively. AR tumor cells were transfected with control siRNA or

ATG4D

siRNA using Lipofectamine. Subsequently

the protein expression levels of ATG4D

LC3-Ⅱ and p62 were detected by Western blotting

and apoptotic rates were analyzed w

ith flow cytometry. A reporter plasmid containing the ATG4D promoter was constructed and transfected into control and AR tumor cells

respectively; after 24 h

luciferase reporter gene assay was employed to detect the changes in the activity of ATG4D promoter. To assess cell stability

the control or AR tumor cells were treated with actinomycin D (5 μg/mL) or cycloheximide (50 μg/mL)

and then harvested at 0

and 8 h after treatment. The mRNA and protein levels of

ATG4D

were determined by qRT-PCR and Western blotting

respectively.

Results

Compared with the control tumor cells

the AR tumor cells showed significantly enhanced autophagy

with significantly elevated LC3-Ⅱ levels (

0.01) and markedly reduced p62 levels (

0.01). Inhibition of autophagy using CQ significantly increased apoptosis in AR tumor cells (

0.01). qRT-PCR and Western blotting revealed significantly elevated

ATG4D

mRNA and protein levels in AR tumor cells compared with the control cells (

0.01).

ATG4D

siRNA transfection significantly inhibited

ATG4D

expression

downregulated LC3-Ⅱ

upregulated p62

and promoted apoptosis in AR tumor cells (

0.01).

ATG4D

promoter activity did not differ significantly between AR and control tumor cells. However

after actinomycin D treatment

ATG4D

mRNA expression was significantly higher in AR tumor cells at all time points (

0.001)

indicating enhanced mRNA stability. In contrast

cycloheximide treatment showed no significant change in ATG4D protein levels over time in AR tumor cells

suggesting unaltered protein stability.

Conclusion

Enhanced autophagy caused by

ATG4D

upregulation promotes AR in tumor cells.

关键词

Keywords

references

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