通过系统性阳离子材料筛选优化牛奶外泌体载体以实现mRNA的高效肺部靶向递送

罗明星; 廖睿; 关山; 张卫军; 罗萍; 张怡; 程平; 李飏; 邹全明

doi:10.16016/j.2097-0927.202511021

您当前的位置：

首页 >

文章列表页 >

通过系统性阳离子材料筛选优化牛奶外泌体载体以实现mRNA的高效肺部靶向递送

基础医学 | 更新时间：2026-03-02

- 通过系统性阳离子材料筛选优化牛奶外泌体载体以实现mRNA的高效肺部靶向递送
- Optimizing milk-derived exosome carriers through systematic cationic material screening for efficient pulmonary-targeted mRNA delivery
- 陆军军医大学学报 2026年48卷第4期页码：407-419
- 作者机构：
  
  1.陆军军医大学（第三军医大学），药学与检验医学系，重庆
  2.陆军军医大学（第三军医大学），第一附属医院药剂科，重庆
- 作者简介：
  
  李飏，E-mail： liyang871419@163.com
  邹全明，E-mail： qmzou2007@163.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金面上项目(82173764;32370993);重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2025NSCQ-GPX0624);Corresponding authors： LI Yang, E-mail： liyang871419@163.com;ZOU Quanming, E-mail： qmzou2007@163.com
- DOI：10.16016/j.2097-0927.202511021
  中图分类号： R394.6;R914.5;R944.9
- 收稿：2025-11-04，
  
  修回：2026-01-09，
  
  录用：2026-01-16，
  
  纸质出版：2026-02-28
- 稿件说明：
移动端阅览
罗明星，廖睿，关山，等.通过系统性阳离子材料筛选优化牛奶外泌体载体以实现mRNA的高效肺部靶向递送［J］.陆军军医大学学报，2026，48（04）：407-419.DOI：10.16016/j.2097-0927.202511021.

LUO M X，LIAO R，GUAN S，et al.Optimizing milk-derived exosome carriers through systematic cationic material screening for efficient pulmonary-targeted mRNA delivery［J］.J Army Med Univ，2026，48（04）：407-419.DOI：10.16016/j.2097-0927.202511021.
罗明星，廖睿，关山，等.通过系统性阳离子材料筛选优化牛奶外泌体载体以实现mRNA的高效肺部靶向递送［J］.陆军军医大学学报，2026，48（04）：407-419.DOI：10.16016/j.2097-0927.202511021. DOI：

LUO M X，LIAO R，GUAN S，et al.Optimizing milk-derived exosome carriers through systematic cationic material screening for efficient pulmonary-targeted mRNA delivery［J］.J Army Med Univ，2026，48（04）：407-419.DOI：10.16016/j.2097-0927.202511021. DOI：

摘要

目的

通过系统性筛选阳离子修饰材料，旨在构建一种工程化的牛奶来源外泌体（milk-derived exosome， mExos）载体，以实现信使核糖核酸（messenger RNA， mRNA）在呼吸道内的高效递送。

方法

采用超速离心法提取mExos，并通过电穿孔法将体外转录的萤火虫荧光素酶（firefly luciferase， Fluc）或增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）mRNA负载于mExos中。使用壳聚糖（chitosan， CS）、聚乙烯亚胺（polyethylenimine， PEI）、聚（β-氨基酯）［poly （β-amino ester）， PBAE］、阳离子脂质（1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride， DOTAP）及鱼精蛋白分别对负载mRNA的mExos进行修饰。采用动态光散射、纳米颗粒追踪分析、流式细胞术、荧光素酶报告基因检测等方法系统评价各修饰载体的的粒径、电位、胶体稳定性、细胞摄取、mRNA转染效率及细胞毒性。选用50只6~8周龄雌性BALB/c小鼠（体质量约20 g），经鼻内滴注染料标记或负载Fluc-mRNA的制剂，采用小动物活体成像系统观察制剂在其体内分布与肺部转染情况，并于给药24 h后取主要器官进行组织病理学和血清生化分析。

结果

成功构建了系列阳离子修饰mExos。经筛选，壳聚糖修饰的mExos（Chitosan-modified milk exosomes， CS-mExos）在保持合适粒径和良好稳定性（48 h内PDI无显著变化）的前提下，其表面电位发生了反转。体外实验显示，CS-mExos在16HBE和A549细胞中的摄取效率分别较未修饰mExos提高2.56倍（

0.001）和4.56倍（

0.001），并显著提升Fluc-mRNA的转染效率达28.9倍（

0.001）和26.5倍（

0.001），且无明显细胞毒性（细胞活力

95%）。活体成像表明，CS-mExos经鼻给药后可特异性富集于肺部并长效滞留至少72 h，且介导的Fluc表达在给药后6 h达峰值，强度为mExos组的9.5倍。组织病理学与血清生化分析显示，CS-mExos未引起明显脏器损伤或肝功能、肾功能指标异常。

结论

通过系统性筛选，确定CS为优化mExos的mRNA递送性能的最佳阳离子修饰材料。基于此构建的CS-mExos载体能高效靶向递送mRNA至呼吸道，显著提升肺部转染效率并具备良好生物安全性。

Abstract

Objective To construct an engineered milk-derived exosome (mExos) vector for efficient messenger RNA (mRNA) delivery to the respiratory tract by systematically screening cationic modification materials.

Methods

mExos were isolated

via

ultracentrifugation

followed by electroporation-mediat

ed loading of firefly luciferase (Fluc) or enhanced green fluorescent protein (EGFP) mRNA. Chitosan (CS)

polyethyleneimine (PEI)

poly(beta-amino ester) (PBAE)

cationic lipid (DOTAP)

and protamine were used to modify mRNA-loaded mExos. Dynamic light scattering

nanoparticle tracking analysis

flow cytometry and luciferase reporter assay were employed to evaluate particle size

zeta potential

colloidal stability

cellular uptake

transfection efficiency

and cytotoxicity. Fifty female BALB/c mice (6 to 8 weeks

about 20 g) received intranasal administration of dye-labeled or Fluc-mRNA-loaded formulations.

In vivo

distribution and pulmonary transfection kinetics were monitored by IVIS imaging

while histopathology and serum biochemistry of major organs were analyzed at 24 h post-administration.

Results

Cationic-modified mExos were successfully constructed. CS-modified mExos (CS-mExos) demonstrated surface charge reversal while maintaining optimal size and stability (PDI unchanged within 48 h).

In vitro

CS-mExos enhanced cellular uptake in 16HBE and A549 cells by 2.56-fold (

0.001) and 4.56-fold (

0.001)

respectively

and increased Fluc-mRNA transfection efficiency by 28.9-fold (

0.001) and 26.5-fold (

0.001) versus unmodified mExos

with

95% cell viability.

In vivo

imaging revealed CS-mExos specifically accumulated in the lungs with sustained retention

72 h

mediating 9.5-fold higher peak Fluc-mRNA expression at 6 h post-administration. Histopathology and serum biochemistry confirmed no significant organ damage or abnormal hepatic/renal indices.

Conclusion

Systematic screening identified chitosan as the optimal cationic material for engineering milk exosomes. The developed CS-mExos vector enables efficient targeted mRNA delivery to the respiratory tract with enhanced pulmonary transfection and favorable biosafety.

关键词

Keywords

references

POLACK F P ， THOMAS S J ， KITCHIN N ， et al . Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA covid-19 vaccine ［J］. N Engl J Med ， 2020 ， 383 （ 27 ）： NEJMoa2034577 . DOI： 10.1056/NEJMoa2034577 http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa2034577 .

BADEN L R ， EL SAHLY H M ， ESSINK B ， et al . Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine ［J］. N Engl J Med ， 2021 ， 384 （ 5 ）： NEJMoa2035389 . DOI： 10.1056/NEJMoa2035389 http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa2035389 .

MIAO L ， ZHANG Y ， HUANG L . mRNA vaccine for cancer immunotherapy ［J］. Mol Cancer ， 2021 ， 20 （ 1 ）： 41 . DOI： 10.1186/s12943-021-01335-5 http://dx.doi.org/10.1186/s12943-021-01335-5 .

YE Z F ， HARMON J ， NI W ， et al . The mRNA vaccine revolution： COVID-19 has launched the future of vaccinology ［J］. ACS Nano ， 2023 ， 17 （ 16 ）： 15231 - 15253 . DOI： 10.1021/acsnano.2c12584 http://dx.doi.org/10.1021/acsnano.2c12584 .

WENG Y H ， LI C H ， YANG T R ， et al . The challenge and prospect of mRNA therapeutics landscape ［J］. Biotechnol Adv ， 2020 ， 40 ： 107534 . DOI： 10.1016/j.biotechadv. 2020. 107534 http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2020.107534 .

VERBEKE R ， HOGAN M J ， LORÉ K ， et al . Innate immune mechanisms of mRNA vaccines ［J］. Immunity ， 2022 ， 55 （ 11 ）： 1993 - 2005 . DOI： 10.1016/j.immuni.2022.10.014 http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2022.10.014 .

SHARMA V ， DAS MUKHOPADHYAY C . Exosome as drug delivery system： Current advancements ［J］. Extracell Vesicle ， 2024 ， 3 ： 100032 . DOI： 10.1016/j.vesic. 2023. 100032 http://dx.doi.org/10.1016/j.vesic.2023.100032 .

KALLURI R ， LEBLEU V S . The biology， function， and biomedical applications of exosomes ［J］. Science ， 2020 ， 367 （ 6478 ）： eaau6977 . DOI： 10.1126/science.aau6977 http://dx.doi.org/10.1126/science.aau6977 .

ADRIANO B ， COTTO N M ， CHAUHAN N ， et al . Milk exosomes： Nature’s abundant nanoplatform for theranostic applications ［J］. Bioact Mater ， 2021 ， 6 （ 8 ）： 2479 - 2490 . DOI： 10.1016/j.bioactmat.2021.01.009 http://dx.doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.01.009 .

LI S Y ， TANG Y ， DOU Y S . The potential of milk-derived exosomes for drug delivery ［J］. Curr Drug Deliv ， 2021 ， 18 （ 6 ）： 688 - 699 . DOI： 10.2174/1567201817666200817112503 http://dx.doi.org/10.2174/1567201817666200817112503 .

BONSERGENT E ， GRISARD E ， BUCHRIESER J ， et al . Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells ［J］. Nat Commun ， 2021 ， 12 （ 1 ）： 1864 . DOI： 10.1038/s41467-021-22126-y http://dx.doi.org/10.1038/s41467-021-22126-y .

SALUNKHE S ， DHEERAJ ， BASAK M ， et al . Surface functionalization of exosomes for target-specific delivery and in vivo imaging & tracking： Strategies and significance ［J］. J Control Release ， 2020 ， 326 ： 599 - 614 . DOI： 10.1016/j.jconrel.2020.07.042 http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2020.07.042 .

RICHARDSON J J ， EJIMA H . Surface engineering of extracellular vesicles through chemical and biological strategies ［J］. Chem Mater ， 2019 ， 31 （ 7 ）： 2191 - 2201 . DOI： 10.1021/acs.chemmater.9b00050 http://dx.doi.org/10.1021/acs.chemmater.9b00050 .

HOSSEINI-KHARAT M ， BREMMELL K E ， GRUBOR-BAUK B ， et al . Enhancing non-viral DNA delivery systems： Recent advances in improving efficiency and target specificity ［J］. J Control Release ， 2025 ， 378 ： 170 - 194 . DOI： 10.1016/j.jconrel.2024.12.002 http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2024.12.002 .

ZHANG M Z ， CHEN X X ， LI C ， et al . Charge-reversal nanocarriers： an emerging paradigm for smart cancer nanomedicine ［J］. J Control Release ， 2020 ， 319 ： 46 - 62 . DOI： 10.1016/j.jconrel.2019.12.024 http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2019.12.024 .

CASPER J ， SCHENK S H ， PARHIZKAR E ， et al . Polyethylenimine （PEI） in gene therapy： Current status and clinical applications ［J］. J Control Release ， 2023 ， 362 ： 667 - 691 . DOI： 10.1016/j.jconrel.2023.09.001 http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.09.001 .

IQBAL S ， ZHAO Z X . Poly （β amino esters） copolymers： Novel potential vectors for delivery of genes and related therapeutics ［J］. Int J Pharm ， 2022 ， 611 ： 121289 . DOI： 10.1016/j.ijpharm.2021.121289 http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpharm.2021.121289 .

HOU X C ， ZAKS T ， LANGER R ， et al . Lipid nanoparticles for mRNA delivery ［J］. Nat Rev Mater ， 2021 ， 6 （ 12 ）： 1078 - 1094 . DOI： 10.1038/s41578-021-00358-0 http://dx.doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0 .

JARZEBSKA N T ， MELLETT M ， FREI J ， et al . Protamine-based strategies for RNA transfection ［J］. Pharmaceutics ， 2021 ， 13 （ 6 ）： 877 . DOI： 10.3390/pharmaceutics13060877 http://dx.doi.org/10.3390/pharmaceutics13060877 .

SARANYA N ， MOORTHI A ， SARAVANAN S ， et al . Chitosan and its derivatives for gene delivery ［J］. Int J Biol Macromol ， 2011 ， 48 （ 2 ）： 234 - 238 . DOI： 10.1016/j.ijbiomac.2010.11.013 http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2010.11.013 .

PALAKURTHI S S ， SHAH B ， KAPRE S ， et al . A comprehensive review of challenges and advances in exosome-based drug delivery systems ［J］. Nanoscale Adv ， 2024 ， 6 （ 23 ）： 5803 - 5826 .

GUO Z Y ， TANG Y ， CHENG Y C . Exosomes as targeted delivery drug system： advances in exosome loading， surface functionalization and potential for clinical application ［J］. Curr Drug Deliv ， 2024 ， 21 （ 4 ）： 473 - 487 . DOI： 10.2174/1567201819666220613150814 http://dx.doi.org/10.2174/1567201819666220613150814 .

TIMOFEEVA A M ， PARAMONIK A P ， SEDYKH S S ， et al . Milk exosomes： next-generation agents for delivery of anticancer drugs and therapeutic nucleic acids ［J］. Int J Mol Sci ， 2023 ， 24 （ 12 ）： 10194 . DOI： 10.3390/ijms241210194 http://dx.doi.org/10.3390/ijms241210194 .

XIE X X ， ZHOU X ， CHEN W ， et al . Hybrid exosome-liposome nanoparticles for dual modulation of neuroinflammation and lipid metabolism in ischemic stroke ［J］. ACS Nano ， 2025 ， 19 （ 37 ）： 33567 - 33586 . DOI： 10.1021/acsnano.5c11417 http://dx.doi.org/10.1021/acsnano.5c11417 .

HU T Q ， ZHOU C K ， CHEN Y X ， et al . TLyp-1-modified exosome-mediated delivery of circRAPGEF5 ASO inhibits lung adenocarcinoma metastasis via regulating the miR-570-3p/SPP1 axis ［J］. Mater Today Bio ， 2025 ， 35 ： 102416 . DOI： 10.1016/j.mtbio.2025.102416 http://dx.doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.102416 .

SHUAI Q ， ZHU F T ， ZHAO M D ， et al . mRNA delivery via non-viral carriers for biomedical applications ［J］. Int J Pharm ， 2021 ， 607 ： 121020 . DOI： 10.1016/j.ijpharm. 2021.121020 http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpharm.2021.121020 .

ACHARYA B ， BEHERA A ， DESHMUKH K ， et al . Biocompatibility， biodegradability， and toxicity evaluations of chitosan nanoparticles ［M］// Fundamentals and biomedical applications of chitosan nanoparticles . Amsterdam ： Elsevier ， 2025 ： 139 - 187 . DOI： 10.1016/b978-0-443-14088-4.00007-1 http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-443-14088-4.00007-1 .

STEFANACHE A ， LUNGU I I ， ANTON N ， et al . Chitosan nanoparticle-based drug delivery systems： advances， challenges， and future perspectives ［J］. Polymers ， 2025 ， 17 （ 11 ）： 1453 . DOI： 10.3390/polym17111453 http://dx.doi.org/10.3390/polym17111453 .

ISMAIL A ， CHOU S F . Polyethylenimine carriers for drug and gene delivery ［J］. Polymers ， 2025 ， 17 （ 15 ）： 2150 . DOI： 10.3390/polym17152150 http://dx.doi.org/10.3390/polym17152150 .

PATHAK R ， BHATT S ， PUNETHA V D ， et al . Chitosan nanoparticles and based composites as a biocompatible vehicle for drug delivery： a review ［J］. Int J Biol Macromol ， 2023 ， 253 ： 127369 . DOI： 10.1016/j.ijbiomac.2023.127369 http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.127369 .

OBEIDAT W M ， LAHLOUH I K . Chitosan nanoparticles： approaches to preparation， key properties， drug delivery systems， and developments in therapeutic efficacy ［J］. AAPS PharmSciTech ， 2025 ， 26 （ 5 ）： 108 . DOI： 10.1208/s12249-025-03100-z http://dx.doi.org/10.1208/s12249-025-03100-z .

浏览量

下载量

CSCD

文章被引用时，请邮件提醒。

提交

工具集

关联资源

乙二醇壳聚糖-二乙烯三胺五乙酸的合成及相对安全性研究

聚乙二醇化壳聚糖纳米粒的制备及局部滴眼给药性能评价

载内皮抑素壳聚糖纳米粒联合顺铂对小鼠Lewis肺癌移植瘤的治疗作用

壳聚糖纳米微粒荧光探针的制备及特性研究

负载转化生长因子β3微球的壳聚糖三维支架的制备