浏览全部资源
扫码关注微信
基于CRISPR-Cas9敲除系统的胚胎干细胞基态多能性退出调控基因的筛选与鉴定
Screening and identification of genes for exiting naïve pluripotency in embryonic stem cells using the CRISPR-Cas9 knockout system
- 陆军军医大学学报 2025年47卷第18期 页码：2223-2236
- 作者机构：
1.陆军军医大学（第三军医大学）基础医学院：，基础医学教学实验中心，重庆
2.陆军军医大学（第三军医大学）基础医学院：，组织胚胎学教研室，重庆
3.联勤保障部队第九二七医院神经内分泌风湿免疫科，云南普洱
- 作者简介：
余 梦，E-mail：ymqs0909@yeah.net
李红丽，E-mail：lihongli@tmmu.edu.cn
- 基金信息：重庆市器官智能生物制造工程研究中心开放项目(CQERC-OIBM20241007);Corresponding authors： YU Meng, E-mail： ymqs0909@yeah.net;LI Hongli, E-mail： lihongli@tmmu.com.cn
DOI：10.16016/j.2097-0927.202507082
中图分类号： R321;R329.21;R394.3收稿日期：2025-07-24，
修回日期：2025-09-01，
录用日期：2025-09-02，
纸质出版日期：2025-09-30
- 稿件说明：
移动端阅览
杨艺，阮艳，张俊磊，等.基于CRISPR-Cas9敲除系统的胚胎干细胞基态多能性退出调控基因的筛选与鉴定［J］.陆军军医大学学报，2025，47（18）：2223-2236.DOI：10.16016/j.2097-0927.202507082.
YANG YI，RUAN YAN，ZHANG JUNLEI，et al.Screening and identification of genes for exiting naïve pluripotency in embryonic stem cells using the CRISPR-Cas9 knockout system［J］.J Army Med Univ，2025，47（18）：2223-2236.DOI：10.16016/j.2097-0927.202507082.
杨艺，阮艳，张俊磊，等.基于CRISPR-Cas9敲除系统的胚胎干细胞基态多能性退出调控基因的筛选与鉴定［J］.陆军军医大学学报，2025，47（18）：2223-2236.DOI：10.16016/j.2097-0927.202507082. DOI：
YANG YI，RUAN YAN，ZHANG JUNLEI，et al.Screening and identification of genes for exiting naïve pluripotency in embryonic stem cells using the CRISPR-Cas9 knockout system［J］.J Army Med Univ，2025，47（18）：2223-2236.DOI：10.16016/j.2097-0927.202507082. DOI：
摘要
目的
2
系统性鉴定调控胚胎干细胞（embryonic stem cells， ESC）基态多能性退出的关键基因，为深入解析多能性状态转换及早期细胞命运决定机制提供新靶点和理论依据。
方法
2
利用全基因组Brie敲除文库感染Nanog-绿色荧光蛋白（Nanog-green fluorescent protein，Nan
og-GFP）报告基因标记的ESC，在白血病抑制因子/血清（leukemia inhibitory factor/serum，LIF/S）条件下持续培养14 d；通过流式细胞术分选Nanog-GFP⁺（基态）与Nanog-GFP⁻（始发态）细胞群，提取基因组DNA进行高通量测序；采用MAGeCK软件分析GFP⁻/Input、GFP
+
/Input与GFP⁺/GFP⁻组的差异基因，利用Metascape和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）进行功能富集分析；基于筛选结果构建候选基因敲除模型，通过细胞形态观察、
Nanog
阳性率检测、克隆形成实验及分子标志物检测评估候选基因功能。
结果
2
在GFP⁺/Input筛选中，鉴定出2 921个负向变化基因（主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程）和1 393个正向变化基因（主要富集于神经系统发育、糖代谢和脉管系统发育等过程）。在GFP
-
/Input筛选中，鉴定到2 765个负向变化基因（主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程）和1 303个正向变化基因（主要富集于神经发育、细胞存活、内皮迁移等过程）。在GFP⁺/GFP
-
筛选中，鉴定出1 001个负向变化基因［主要参与细胞应激响应和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路抑制］和983个正向变化基因［主要参与成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶（fibroblast growth factor/extracellular signal-regulated kinase，FGF/ERK）信号通路和糖代谢过程］，其中不仅包括已知的多能性维持因子（如
Nanog
、
Nr5a2
、
Klf2
、
Klf4
）及多能性退出相关基因（如
Gata6
、
Grb2
、
Zeb1
、
Fgfr1
），还包括一些在基态多能性退出过程中功能尚未明确的基因（如
Dmrt1
、
Rxra
、
Zbtb14
和
Tmem41b
）。候选基因功能验证显示，瞬时敲除
Dmrt1
、
Tmem41b
和
Hic2
的ESC中
Nanog
⁺细胞比例显著升高（
P
<
0.01），表明这些基因可能抑制基态多能性退出。
Dmrt1
稳定敲除使ESC呈现更基态的表型，表现为克隆形态变紧密、呈穹隆状，未分化克隆比例增加（
P
<
0.01），基态多能性标志基因（如
Nanog
、
Nr5a2
、
Dppa3
）表达上调（
P
<
0.01），而始发态标志基因（如
Fgf5
、
Lefty1
、
Dnmt3b
）表达下调（
P
<
0.01）。回复表达
Dmrt1
可逆转上述表型。
结论
2
本研究通过全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定出调控ESC基态多能性退出的候选基因集，明确
Dmrt1
在促进ESC基态多能性退出过程中的关键作用。
Abstract
Objective
2
To systematically identify the key genes regulating the exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells (ESCs) in order to provide novel targets and theoretical insights into the mechanisms for pluripotency transition and early cell fate determination.
Methods
2
Nanog-green fluorescent protein (Nanog-GFP) reporter-labeled ESCs were infected with a genome-wide Brie knockout library
and further cultured under leukemia inhibitory factor/serum (LIF/S) conditions for 14 d. Flow cytometry was used to sort Nanog-GFP⁺(naïve-state) and Nanog-GFP
-
(primed state) cell populations
followed by genomic DNA extraction and high-throughput sequencing. Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR/Cas9 Knockout (MAGeCK) was applied to identify differential genes between GFP⁻/Input
GFP⁺/Input
and GFP⁺/GFP⁻ groups. Metascape and Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) were conducted for functional enrichment analysis. Then the obtained candidate genes were employed to construct knockout models
and their roles were assessed through cell morphology observation
Nanog-positive rate detection
colony formation assays
and pluripotency gene expression analysis.
Results
2
The GFP⁺/Input screening revealed 2 921 negatively regulated genes (mainly enriched in basic life processes
such as RNA metabolism and cell cycle) and 1 393 positively regulated genes (enriched in the processes of nervous system development
carbohydrate metabolism
and vascular system development). In the GFP⁻/Input screening
2 765 negatively regulated genes (enriched in RNA metabolism
cell cycle
and other fundamental processes) and 1 303 positively regulated genes (enriched in neural development
cell survival
and endothelial migration) were identified. The GFP⁺/GFP⁻ comparison identified 1 001 negatively regulated genes [involved in stress response and inhibition of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling
]
and 983 positively regulated genes [related to fibroblast growth factor/extracellular signal-regulated kinase (FGF/ERK) signaling pathway and glucose metabolism). These genes
were not only known pluripotency regulators (
e.g.
Nanog
Nr5a2
Klf2
Klf4
) and exit-associated genes (
e.g.
Gata6
Grb2
Zeb1
Fgfr1
)
but also some novel candidates (
e.g.
Dmrt1
Rxra
Zbtb14
and
Tmem41b
). Functional validation showed that transient knockout of
Dmrt1
Tmem41b
and
Hic2
significantly increased the proportion of
Nanog
⁺ cells (
P
<
0.01)
suggesting their role in suppressing ground-state exit. ESCs with stable
Dmrt1
knockout exhibited a more naïve-state phenotype
presenting compact
dome-shaped colonies
with increased ratio of undifferentiated colonies (
P
<
0.01)
up-regulation of ground-state markers (
Nanog
Nr5a2
Dppa3
P
<
0.01)
and down-regulation of primed-state markers (
Fgf5
Lefty1
Dnmt3b
P
<
0.01). Rescue experiments for
Dmrt1
expression reversed these above phenotypes.
Conclusion
2
A candidate gene set regulating exit from naïve pluripotency in ESC is screened out and identified with genome-wide CRISPR. Our findings implicate
Dmrt1
plays a critical role in promoting the exit.
关键词
Keywords
references
BUECKER C ， SRINIVASAN R ， WU Z X ， et al . Reorganization of enhancer patterns in transition from naïve to primed pluripotency ［J］. Cell Stem Cell ， 2014 ， 14 （ 6 ）： 838 - 853 . DOI： 10.1016/j.stem.2014.04.003 http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2014.04.003 .
HAYASHI K ， OHTA H ， KURIMOTO K ， et al . Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells ［J］. Cell ， 2011 ， 146 （ 4 ）： 519 - 532 . DOI： 10.1016/j.cell.2011.06.052 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2011.06.052 .
KURIMOTO K ， YABUTA Y ， HAYASHI K ， et al . Quantitative dynamics of chromatin remodeling during germ cell specification from mouse embryonic stem cells ［J］. Cell Stem Cell ， 2015 ， 16 （ 5 ）： 517 - 532 . DOI： 10.1016/j.stem.2015.03.002 http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2015.03.002 .
HACKETT J A ， SURANI M A . Regulatory principles of pluripotency： from the ground state up ［J］. Cell Stem Cell ， 2014 ， 15 （ 4 ）： 416 - 430 . DOI： 10.1016/j.stem.2014.09.015 http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2014.09.015 .
LEITCH H G ， SMITH A . The mammalian germline as a pluripotency cycle ［J］. Development ， 2013 ， 140 （ 12 ）： 2495 - 2501 . DOI： 10.1242/dev.091603 http://dx.doi.org/10.1242/dev.091603 .
KALKAN T ， SMITH A . Mapping the route from naïve pluripotency to lineage specification ［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci ， 2014 ， 369 （ 1657 ）： 20130540 . DOI： 10.1098/rstb.2013.0540 http://dx.doi.org/10.1098/rstb.2013.0540 .
CHEN X ， XU H ， YUAN P ， et al . Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells ［J］. Cell ， 2008 ， 133 （ 6 ）： 1106 - 1117 . DOI： 10.1016/j.cell.2008.04.043 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2008.04.043 .
DUNN S J ， MARTELLO G ， YORDANOV B ， et al . Defining an essential transcription factor program for naïve pluripotency ［J］. Science ， 2014 ， 344 （ 6188 ）： 1156 - 1160 . DOI： 10.1126/science.1248882 http://dx.doi.org/10.1126/science.1248882 .
MARSON A ， LEVINE S S ， COLE M F ， et al . Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells ［J］. Cell ， 2008 ， 134 （ 3 ）： 521 - 533 . DOI： 10.1016/j.cell.2008.07.020 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2008.07.020 .
RESPUELA P ， NIKOLIĆ M ， TAN M J ， et al . Foxd3 promotes exit from naïve pluripotency through enhancer decommissioning and inhibits germline specification ［J］. Cell Stem Cell ， 2016 ， 18 （ 1 ）： 118 - 133 . DOI： 10.1016/j.stem.2015.09.010 http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2015.09.010 .
YANG S H ， ANDRABI M ， BISS R ， et al . ZIC3 controls the transition from naïve to primed pluripotency ［J］. Cell Rep ， 2019 ， 27 （ 11 ）： 3215 - 3227.e6 . DOI： 10.1016/j.celrep.2019.05.026 http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2019.05.026 .
YING Q L ， WRAY J ， NICHOLS J ， et al . The ground state of embryonic stem cell self-renewal ［J］. Nature ， 2008 ， 453 （ 7194 ）： 519 - 523 . DOI： 10.1038/nature06968 http://dx.doi.org/10.1038/nature06968 .
SMITH A . Formative pluripotency： the executive phase in a developmental continuum ［J］. Development ， 2017 ， 144 （ 3 ）： 365 - 373 . DOI： 10.1242/dev.142679 http://dx.doi.org/10.1242/dev.142679 .
YAMAJI M ， UEDA J ， HAYASHI K ， et al . PRDM14 ensures naïve pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells ［J］. Cell Stem Cell ， 2013 ， 12 （ 3 ）： 368 - 382 . DOI： 10.1016/j.stem.2012.12.012 http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2012.12.012 .
ZHANG J L ， LIU G K ， RUAN Y ， et al . Dax1 and Nanog act in parallel to stabilize mouse embryonic stem cells and induced pluripotency ［J］. Nat Commun ， 2014 ， 5 ： 5042 . DOI： 10.1038/ncomms6042 http://dx.doi.org/10.1038/ncomms6042 .
SHALEM O ， SANJANA N E ， HARTENIAN E ， et al . Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells ［J］. Science ， 2014 ， 343 （ 6166 ）： 84 - 87 . DOI： 10.1126/science.1247005 http://dx.doi.org/10.1126/science.1247005 .
LANGMEAD B ， SALZBERG S L . Fast gapped-read alignment with bowtie 2 ［J］. Nat Methods ， 2012 ， 9 （ 4 ）： 357 - 359 . DOI： 10.1038/nmeth.1923 http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.1923 .
LI W ， XU H ， XIAO T F ， et al . MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens ［J］. Genome Biol ， 2014 ， 15 （ 12 ）： 554 . DOI： 10.1186/s13059-014-0554-4 http://dx.doi.org/10.1186/s13059-014-0554-4 .
ZHOU Y Y ， ZHOU B ， PACHE L ， et al . Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets ［J］. Nat Commun ， 2019 ， 10 （ 1 ）： 1523 . DOI： 10.1038/s41467-019-09234-6 http://dx.doi.org/10.1038/s41467-019-09234-6 .
SUBRAMANIAN A ， TAMAYO P ， MOOTHA V K ， et al . Gene set enrichment analysis： a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A ， 2005 ， 102 （ 43 ）： 15545 - 15550 . DOI： 10.1073/pnas.0506580102 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0506580102 .
LI M ， YU J S L ， TILGNER K ， et al . Genome-wide CRISPR-KO screen uncovers mTORC1-mediated Gsk3 regulation in naïve pluripotency maintenance and dissolution ［J］. Cell Rep ， 2018 ， 24 （ 2 ）： 489 - 502 . DOI： 10.1016/j.celrep. 2018.06.027 http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2018.06.027 .
YANG P Y ， HUMPHREY S J ， CINGHU S ， et al . Multi-omic profiling reveals dynamics of the phased progression of pluripotency ［J］. Cell Syst ， 2019 ， 8 （ 5 ）： 427 - 445.e10 . DOI： 10.1016/j.cels.2019.03.012 http://dx.doi.org/10.1016/j.cels.2019.03.012 .
SLADITSCHEK H L ， NEVEU P A . A gene regulatory network controls the balance between mesendoderm and ectoderm at pluripotency exit ［J］. Mol Syst Biol ， 2019 ， 15 （ 12 ）： e9043 . DOI： 10.15252/msb.20199043 http://dx.doi.org/10.15252/msb.20199043 .
韩士超 ， 马帅军 ， 戚若晨 ， 等 . 国际首例6-基因编辑猪-猴肝肾联合移植围术期治疗研究 ［J］. 空军军医大学学报 ， 2024 ， 45 （ 1 ）： 9 - 14 . DOI： 10.13276/j.issn.2097-1656.2024.01.003 http://dx.doi.org/10.13276/j.issn.2097-1656.2024.01.003 .
HAN S C ， MA S J ， QI R C ， et al . Perioperative treatment of the first international 6-gene-edited pig-to- Rhesus macaque combined liver and kidney transplantation ［J］. J Air Force Med Univ ， 2024 ， 45 （ 1 ）： 9 - 14 . DOI： 10.13276/j.issn.2097-1656.2024.01.003 http://dx.doi.org/10.13276/j.issn.2097-1656.2024.01.003 .
MACDOUGALL M S ， CLARKE R ， MERRILL B J . Intracellular Ca 2+ homeostasis and nuclear export mediate exit from naïve pluripotency ［J］. Cell Stem Cell ， 2019 ， 25 （ 2 ）： 210 - 224.e6 . DOI： 10.1016/j.stem.2019.04.015 http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2019.04.015 .
YANG B ， KUANG J Q ， WU C M ， et al . Screening genes promoting exit from naïve pluripotency based on genome-scale CRISPR-Cas9 knockout ［J］. Stem Cells Int ， 2020 ， 2020 ： 8483035 . DOI： 10.1155/2020/8483035 http://dx.doi.org/10.1155/2020/8483035 .
WANG X ， PING C Y ， TAN P W ， et al . HnRNPLL controls pluripotency exit of embryonic stem cells by modulating alternative splicing of Tbx3 and Bptf ［J］. EMBO J ， 2021 ， 40 （ 4 ）： e104729 . DOI： 10.15252/embj.2020104729 http://dx.doi.org/10.15252/embj.2020104729 .
DENG Y ， WANG H H ， LIU X H ， et al . Zbtb14 regulates monocyte and macrophage development through inhibiting Pu.1 expression in zebrafish ［J］. eLife ， 2022 ， 11 ： e80760 . DOI： 10.7554/eLife.80760 http://dx.doi.org/10.7554/eLife.80760 .
XIANG X ， MAO J ， TANG D ， et al . The ZBTB family in cardiac development and diseases ［J］. Biochem Biophys Res Commun ， 2025 ， 771 ： 152026 . DOI： 10.1016/j.bbrc. 2025. 152026 http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2025.152026 .
HUANG D ， XU B L ， LIU L ， et al . TMEM41B acts as an ER scramblase required for lipoprotein biogenesis and lipid homeostasis ［J］. Cell Metab ， 2021 ， 33 （ 8 ）： 1655 - 1670.e8 . DOI： 10.1016/j.cmet.2021.05.006 http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2021.05.006 .
MATSON C K ， ZARKOWER D . Sex and the singular DM domain： insights into sexual regulation， evolution and plasticity ［J］. Nat Rev Genet ， 2012 ， 13 （ 3 ）： 163 - 174 . DOI： 10.1038/nrg3161 http://dx.doi.org/10.1038/nrg3161 .
HIRST C E ， MAJOR A T ， SMITH C A . Sex determination and gonadal sex differentiation in the chicken model ［J］. Int J Dev Biol ， 2018 ， 62 （ 1/2/3 ）： 153 - 166 . DOI： 10.1387/ijdb.170319cs http://dx.doi.org/10.1387/ijdb.170319cs .
WEI Y D ， DU X M ， YANG D H ， et al . Dmrt1 regulates the immune response by repressing the TLR4 signaling pathway in goat male germline stem cells ［J］. Zool Res ， 2021 ， 42 （ 1 ）： 14 - 27 . DOI： 10.24272/j.issn.2095-8137.2020.186 http://dx.doi.org/10.24272/j.issn.2095-8137.2020.186 .
KRENTZ A D ， MURPHY M W ， KIM S ， et al . The DM domain protein DMRT1 is a dose-sensitive regulator of fetal germ cell proliferation and pluripotency ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A ， 2009 ， 106 （ 52 ）： 22323 - 22328 . DOI： 10.1073/pnas.0905431106 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0905431106 .
TAGUCHI J ， SHIBATA H ， KABATA M ， et al . DMRT1-mediated reprogramming drives development of cancer resembling human germ cell tumors with features of totipotency ［J］. Nat Commun ， 2021 ， 12 （ 1 ）： 5041 . DOI： 10.1038/s41467-021-25249-4 http://dx.doi.org/10.1038/s41467-021-25249-4 .
0
浏览量
0
下载量
0
CSCD
- 网络PDF下载
- WORD下载
- Meta-XML下载
- BibTeX下载
- Endnote下载
- RefMan 下载
- NoteExpress下载
- NoteFirst下载
关联资源
相关文章
相关作者
相关机构
- 技术支持由北京北大方正电子有限公司提供 京ICP备09064830号-19
京公网安备11010802024621 - 本系统建议在Chrome、 IE9+ 以上版本浏览器阅读本站内容，360浏览器请切换至极速模式
- Cookies帮助我们提供服务并提供个性化体验。使用本网站，即表示您同意我们使用Cookies
