靶向Trop2的嵌合抗原受体T细胞制备及其体外耗竭状态研究

刘秀盈; 李昕展; 朱晶晶; 刘静静; 冯义超; 王建勋

doi:10.16016/j.2097-0927.202505003

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靶向Trop2的嵌合抗原受体T细胞制备及其体外耗竭状态研究

基础医学 | 更新时间：2025-07-27

- 靶向Trop2的嵌合抗原受体T细胞制备及其体外耗竭状态研究
- Preparation of Trop2-targeted chimeric antigen receptor T cells and study of their exhaustion status in vitro
- 陆军军医大学学报 2025年47卷第15期页码：1750-1759
- 作者机构：
  
  1.北京中医药大学生命科学学院，北京
  2.德州市卫生健康委员会，山东德州
- 作者简介：
  
  王建勋，E-mail： Jianxun.Wang@bucm.edu.cn
- 基金信息：
  
  高层次人才科研启动经费项目(9011451310032)
- DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003
  中图分类号： R392-33;R392.12;R73-362
- 收稿日期：2025-05-06，
  
  修回日期：2025-07-04，
  
  录用日期：2025-07-05，
  
  纸质出版日期：2025-08-15
- 稿件说明：
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刘秀盈，李昕展，朱晶晶，等.靶向Trop2的嵌合抗原受体T细胞制备及其体外耗竭状态研究［J］.陆军军医大学学报，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003.

‍LIU X Y，LI X Z，ZHU J J，et al.Preparation of Trop2-targeted chimeric antigen receptor T cells and study of their exhaustion status in vitro［J］.J Army Med Univ，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003.
刘秀盈，李昕展，朱晶晶，等.靶向Trop2的嵌合抗原受体T细胞制备及其体外耗竭状态研究［J］.陆军军医大学学报，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003. DOI：

‍LIU X Y，LI X Z，ZHU J J，et al.Preparation of Trop2-targeted chimeric antigen receptor T cells and study of their exhaustion status in vitro［J］.J Army Med Univ，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003. DOI：

摘要

目的

设计并构建靶向滋养细胞表面糖蛋白抗原2（trophoblast cell surface antigen 2， Trop2）的嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）细胞，通过重复抗原刺激构建体外细胞耗竭模型，并探究其抗肿瘤活性及耗竭特性。

方法

基于靶向Trop2的戈沙妥珠单链抗体可变区片段（single-chain variable fragment，scFv）序列构建二代CAR质粒，进行逆转录病毒载体颗粒包装。采用Ficoll法分离健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），经OKT-3/IL-2活化后转导CAR病毒载体颗粒制备Trop2 CAR-T细胞，流式细胞术检测MYC标签评估CAR表达率。原代T细胞（primary T cell， P-T）组仅接受相同条件的培养基处理。体外建立人卵巢癌细胞（SKOV3）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-453）及人肺癌细胞（A549）3种典型的实体肿瘤细胞模型，流式细胞术验证Trop2抗原表达，将CAR-T组、P-T组分别与肿瘤细胞共培养，通过荧光素酶法检测不同效应细胞与靶细胞数量比例时的杀伤效率。构建体外耗竭CAR-T模型，利用Incucyte活细胞成像系统动态监测CAR-T长期杀伤能力。流式细胞术检测CAR-T细胞的PD-1和TIM3表达水平，CBA法分析细胞因子分泌水平，结合转录组测序和RT-qPCR验证耗竭相关差异基因。

结果

成功构建了靶向Trop2的二代CAR-T细胞，标签蛋白MYC显示的CAR阳性率为55.42%，体外实验显示，与P-T组相比，其对Trop2高表达肿瘤细胞（MDA-MB-453、SKOV3）具有抗原特异性及剂量依赖性杀伤效应（

0.001）。通过体外重复肿瘤刺激建立的CAR-T细胞耗竭模型分析表明，耗竭状态的Trop2 CAR-T细胞对肿瘤的杀伤能力降低，而P-T细胞几乎无杀伤作用。与原始状态相比，耗竭状态CAR-T细胞表面抑制性受体PD-1和TIM-3表达上调（

0.001），细胞因子分泌功能减弱，转录组分析揭示耗竭细胞出现多个差异表达基因，涉及免疫应答、T细胞受体信号通路等过程呈现下调趋势，而凋亡相关通路呈现激活状态，RT-qPCR分析进一步表明IL3、IL5、IL13等免疫调节基因亦异常表达（

0.05）。

结论

靶向Trop2的二代CAR-T细胞在体外重复抗原刺激诱导的耗竭进程中，表现出抗肿瘤活性下降以及效应功能减弱、耗竭相关分子表达上调等典型耗竭特性。

Abstract

Objective‍　‍To design and construct chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting Trop2

establish an

in vitro

cell exhaustion model through continuous antigen stimulation

and investigate their anti-tumor activity and exhaustion characteristics. Methods‍　‍The second-generation CAR plasmid was constructed based on the single-chain variable fragment (scFv) sequence of Sacituzumab Govitecan targeting Trop2. The viral vector titer was determined by retroviral vector packaging and gradient dilution. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were isolated using Ficoll density gradient centrifugation

and CAR virus vectors were transduced into PBMCs activated with OKT-3/IL-2 to generate Trop2-targeted CAR T cells. CAR expression levels were assessed by flow cytometry using MYC tags.

In vitro

3 tumor cell models were established

including human ovarian cancer cells (SKOV3)

human breast cancer cells (MDA-MB-453)

and human lung cancer cells (A549). The expression of the Trop2 antigen in these models was confirmed using flow cytometry. Additionally

luciferase assay was employed to evaluate the cytotoxic efficiency of Trop2-targeted therapy at various effector-to-target ratios. An

in vitro

CAR-T exhaustion model was developed

and the long-term killing ability of CAR-T cells was dynamically monitored using the Incucyte live-cell imaging system. The PD-1/TIM-3 phenotype of CAR-T cells was analyzed by flow cytometry

and cytokine secretion levels were quantified using the cytometric bead array (CBA). Transcriptomic sequencing and RT-qPCR were employed to validate the differentially expressed genes associated with exhaustion. Results‍　‍The second-generation CAR T cells targeting Trop2 were successfully constructed. Compared to the P-T group

in vitro

experiments demonstrated that these CAR T cells exhibited antigen-specific and dose-dependent cytotoxic effects against tumor cells with high Trop2 expression

such as MDA-MB-453 and SKOV3. A CAR-T cell exhaustion model established through repeated tumor antigen stimulation

in vitro

revealed that

compared to the initial state

the exhausted Trop2 CAR-T cells exhibited significantly reduced tumor-killing capacity while P-T cells showed almost no killing effect

the expression of inhibitory receptors (PD-1 and TIM-3) was up-regulated on the surface of exhausted CAR-T cells

and the secretion of effector cytokines was diminished. Transcriptomic analysis identified multiple differentially expressed genes in the exhausted CAR-T cells. Pathways related to immune response and T cell receptor signaling were down-regulated

while apoptosis-related pathways were activated. RT-qPCR further confirmed abnormal expression of immunoregulatory genes

including IL3

IL5

and IL13 (

0.05). Conclu

sion‍　‍During continuous

in vitro

tumor antigen stimulation

the second-generation CAR-T cells targeting the Trop2 antigen demonstrate declined anti-tumor activity

weakened effector function and up-regulated expression of exhaustion-related molecules.

关键词

Keywords

references

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