土贝母皂苷丙纳米乳的构建及其佐剂效应评价

魏静; 刘姝琳; 叶演; 徐铭琦; 宋振; 邓炎; 孙红武; 马雷; 李海波

doi:10.16016/j.2097-0927.202501034

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土贝母皂苷丙纳米乳的构建及其佐剂效应评价

药学 | 更新时间：2025-04-25

- 土贝母皂苷丙纳米乳的构建及其佐剂效应评价
- 暂无标题
- 陆军军医大学学报 2025年47卷第8期页码：784-793
- 作者机构：
  
  1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江佳木斯
  2.陆军军医大学（第三军医大学）药学与检验医学系微生物与生化药学教研室，国家免疫生物制品工程技术研究中心，重庆
  3.重庆市沙坪坝区陈家桥医院检验科，重庆
- 作者简介：
  
  马雷，E-mail：maleijms@163.com
  李海波，E-mail：lihaibo@tmmu.edu.cn
- 基金信息：
  
  ‍基‍金‍项‍目‍］‍ ‍国家重点研发计划(2021YFC2302603);‍国家自然科学基金面上项目(32270988)
- DOI：10.16016/j.2097-0927.202501034
  中图分类号： R282.71;R944.9;R969.2
- 收稿日期：2025-01-13，
  
  修回日期：2025-02-06，
  
  纸质出版日期：2025-04-30
- 稿件说明：
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魏静,刘姝琳,叶演,等.土贝母皂苷丙纳米乳的构建及其佐剂效应评价[J].陆军军医大学学报,2025,47(08):784-793.

WEI Jing,LIU Shulin,YE Yan,et al.Preparation of tubeimoside Ⅲ nanoemulsion and evaluation of its adjuvant effect[J].J Army Med Univ,2025,47(08):784-793.
魏静,刘姝琳,叶演,等.土贝母皂苷丙纳米乳的构建及其佐剂效应评价[J].陆军军医大学学报,2025,47(08):784-793. DOI：10.16016/j.2097-0927.202501034.

WEI Jing,LIU Shulin,YE Yan,et al.Preparation of tubeimoside Ⅲ nanoemulsion and evaluation of its adjuvant effect[J].J Army Med Univ,2025,47(08):784-793. DOI：10.16016/j.2097-0927.202501034.

摘要

目的

制备土贝母皂苷丙纳米乳（tubeimoside Ⅲ nanoemulsion，TBMⅢ-NE），并评价其疫苗佐剂效应。

方法

利用低能乳化法制备TBMⅢ-NE，采用动态光散射法表征TBMⅢ-NE的粒径和平均分散系数，透射电镜观察TBMⅢ-NE的形态，CCK-8法检测TBMⅢ-NE对骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）的细胞毒性；红细胞溶血实验评价TBMⅢ-NE的体外安全性；激光共聚焦显微镜观察TBMⅢ-NE促进DC2.4对抗原的吞噬作用；TBMⅢ-NE与BMDCs共孵育后，利用流式细胞术检测BMDCs表面CD40、CD86、MHC-Ⅰ和CCR7的表达水平，酶联免疫吸附（ELISA）法检测BMDCs上清中细胞因子的表达水平；新冠病毒抗原RBD与TBMⅢ-NE联用免疫小鼠，ELISA测定小鼠血清中特异性IgG、IgG

、IgG

抗体水平，酶联免疫斑点（ELISpot）法检测小鼠脾淋巴细胞中特异性分泌γ干扰素（IFN-γ）的细胞数量。

结果

制备的空白纳米乳（blank nanoemulsion，BNE）和TBMⅢ-NE的平均粒径分别为25.46 nm和25.89 nm，平均多分散系数分别为0.214和0.125，透射电镜观察TBMⅢ-NE呈均匀“球型”且分散性良好；当TBMⅢ-NE佐剂稀释400倍时，BMDCs存活率约为86%；与游离土贝母皂苷丙（TBMⅢ）相比，TBMⅢ-NE的溶血毒性显著降低（

0.01）；TBMⅢ-NE可促进DC2.4对抗原的吞噬，并显著提高BMDCs表面CCR7的表达水平（

0.05），具有促进树突状细胞向淋巴结迁移的潜力；TBMⅢ-NE还可促进BMDCs培养上清中IL-6和IL-1β的表达（

0.05）；与RBD联用，TBMⅢ-NE可显著提升小鼠血清中特异性IgG、IgG2a、IgG1抗体的水平（

01），并促进脾淋巴细胞中特异性IFN-γ的分泌（

0.01），提示TBMⅢ-NE可以增强特异性T细胞免疫应答。

结论

成功构建出质量稳定、具有高效诱导体液和细胞免疫应答的TBMⅢ-NE。

Abstract

Objective‍　‍To prepare tubeimoside Ⅲ nanoemulsion (TBMⅢ-NE) and evaluate its adjuvant effect in vaccines. Methods‍　‍TBMⅢ-NE was prepared using low-energy emulsification. Dynamic light scattering was used to characterize the particle size and polydispersity index of the obtained TBMⅢ-NE

and transmission electron microscopy (TEM) was employed to observe the morphology. CCK-8 assay was utilized to determine the cytotoxicity of TBMⅢ-NE on bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). The

in vitro

safety of TBMⅢ-NE was evaluated using a hemolysis assay. The ability of TBMⅢ-NE to promote the phagocytosis of antigens by DC2.4 cells was observed using confocal laser microscopy. After co-incubation of TBMⅢ-NE with BMDCs

the expression levels of CD40

CD86

MHC-Ⅰ

and CCR7 on the surface of BMDCs were detected using flow cytometry

and the levels of cytokines in the supernatant of BMDCs were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). After female BALB/c mice were immunized with the SARS-CoV-2 antigen RBD in combination with TBMⅢ-NE

ELISA was conducted to determine the serum levels of specific IgG

IgG2a

and IgG1 antibodies. The number of specific IFN-γ-secreting cells in mouse splenocytes was detected using enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay. Results‍　‍The prepared blank nanoemulsion (BNE) and TBMⅢ-NE were in a particle size of 25.46 and 25.89 nm

and a polydispersity index of 0.214 and 0.125

respectively. TEM displayed that TBMⅢ-NE was in uniform sphere and well dispersed. When the TBMⅢ-NE adjuvant was diluted by 400-fold

the survival rate of BMDCs was approximately 86%. Compared with free TBMⅢ

the hemolytic toxicity of TBMⅢ-NE was significantly reduced (

0.01). TBMⅢ-NE promoted the phagocytosis of antigens by DC2.4 cells and significa

ntly increased the expression of CCR7 on the surface of BMDCs (

0.05)

indicating its potential to promote more dendritic cells to effectively migrate to lymph nodes. TBMⅢ-NE also promoted the expression of IL-6 and IL-1β in the supernatant of BMDCs (

0.05). When combined with RBD

TBMⅢ-NE significantly increased the levels of specific IgG

IgG2a

and IgG1 antibodies in mouse serum (

0.01) and promoted the secretion of specific IFN-γ in splenocytes (

0.01)

indicating that TBMⅢ-NE could enhance specific cellular immune responses. Conclusion‍　‍A stable and highly effective TBMⅢ-NE that can induce humoral and cellular immune responses is successfully prepared.

关键词

Keywords

references

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