Preparation of Trop2-targeted chimeric antigen receptor T cells and study of their exhaustion status
in vitro - Journal of Army Medical University Vol. 47, Issue 15, Pages: 1750-1759(2025)
- 作者机构：
1.北京中医药大学生命科学学院，北京
2.德州市卫生健康委员会，山东德州
- 作者简介：
WANG Jianxun， E-mail： Jianxun.Wang@bucm.edu.cn
- 基金信息：
DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003
CLC： R392-33;R392.12;R73-362Received：06 May 2025，
Revised：04 July 2025，
Accepted：05 July 2025，
Published：15 August 2025
- 稿件说明：
移动端阅览
刘秀盈，李昕展，朱晶晶，等.靶向Trop2的嵌合抗原受体T细胞制备及其体外耗竭状态研究［J］.陆军军医大学学报，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003.
LIU X Y，LI X Z，ZHU J J，et al.Preparation of Trop2-targeted chimeric antigen receptor T cells and study of their exhaustion status in vitro［J］.J Army Med Univ，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003.
刘秀盈，李昕展，朱晶晶，等.靶向Trop2的嵌合抗原受体T细胞制备及其体外耗竭状态研究［J］.陆军军医大学学报，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003. DOI：
LIU X Y，LI X Z，ZHU J J，et al.Preparation of Trop2-targeted chimeric antigen receptor T cells and study of their exhaustion status in vitro［J］.J Army Med Univ，2025，47（15）：1750-1759.DOI：10.16016/j.2097-0927.202505003. DOI：
摘要
目的
2
设计并构建靶向滋养细胞表面糖蛋白抗原2（trophoblast cell surface antigen 2， Trop2）的嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）细胞，通过重复抗原刺激构建体外细胞耗竭模型，并探究其抗肿瘤活性及耗竭特性。
方法
2
基于靶向Trop2的戈沙妥珠单链抗体可变区片段（single-chain variable fragment，scFv）序列构建二代CAR质粒，进行逆转录病毒载体颗粒包装。采用Ficoll法分离健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），经OKT-3/IL-2活化后转导CAR病毒载体颗粒制备Trop2 CAR-T细胞，流式细胞术检测MYC标签评估CAR表达率。原代T细胞（primary T cell， P-T）组仅接受相同条件的培养基处理。体外建立人卵巢癌细胞（SKOV3）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-453）及人肺癌细胞（A549）3种典型的实体肿瘤细胞模型，流式细胞术验证Trop2抗原表达，将CAR-T组、P-T组分别与肿瘤细胞共培养，通过荧光素酶法检测不同效应细胞与靶细胞数量比例时的杀伤效率。构建体外耗竭CAR-T模型，利用Incucyte活细胞成像系统动态监测CAR-T长期杀伤能力。流式细胞术检测CAR-T细胞的PD-1和TIM3表达水平，CBA法分析细胞因子分泌水平，结合转录组测序和RT-qPCR验证耗竭相关差异基因。
结果
2
成功构建了靶向Trop2的二代CAR-T细胞，标签蛋白MYC显示的CAR阳性率为55.42%，体外实验显示，与P-T组相比，其对Trop2高表达肿瘤细胞（MDA-MB-453、SKOV3）具有抗原特异性及剂量依赖性杀伤效应（
P
<
0.001）。通过体外重复肿瘤刺激建立的CAR-T细胞耗竭模型分析表明，耗竭状态的Trop2 CAR-T细胞对肿瘤的杀伤能力降低，而P-T细胞几乎无杀伤作用。与原始状态相比，耗竭状态CAR-T细胞表面抑制性受体PD-1和TIM-3表达上调（
P
<
0.001），细胞因子分泌功能减弱，转录组分析揭示耗竭细胞出现多个差异表达基因，涉及免疫应答、T细胞受体信号通路等过程呈现下调趋势，而凋亡相关通路呈现激活状态，RT-qPCR分析进一步表明IL3、IL5、IL13等免疫调节基因亦异常表达（
P
<
0.05）。
结论
2
靶向Trop2的二代CAR-T细胞在体外重复抗原刺激诱导的耗竭进程中，表现出抗肿瘤活性下降以及效应功能减弱、耗竭相关分子表达上调等典型耗竭特性。
Abstract
Objective To design and construct chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting Trop2
establish an
in vitro
cell exhaustion model through continuous antigen stimulation
and investigate their anti-tumor activity and exhaustion characteristics. Methods The second-generation CAR plasmid was constructed based on the single-chain variable fragment (scFv) sequence of Sacituzumab Govitecan targeting Trop2. The viral vector titer was determined by retroviral vector packaging and gradient dilution. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were isolated using Ficoll density gradient centrifugation
and CAR virus vectors were transduced into PBMCs activated with OKT-3/IL-2 to generate Trop2-targeted CAR T cells. CAR expression levels were assessed by flow cytometry using MYC tags.
In vitro
3 tumor cell models were established
including human ovarian cancer cells (SKOV3)
human breast cancer cells (MDA-MB-453)
and human lung cancer cells (A549). The expression of the Trop2 antigen in these models was confirmed using flow cytometry. Additionally
luciferase assay was employed to evaluate the cytotoxic efficiency of Trop2-targeted therapy at various effector-to-target ratios. An
in vitro
CAR-T exhaustion model was developed
and the long-term killing ability of CAR-T cells was dynamically monitored using the Incucyte live-cell imaging system. The PD-1/TIM-3 phenotype of CAR-T cells was analyzed by flow cytometry
and cytokine secretion levels were quantified using the cytometric bead array (CBA). Transcriptomic sequencing and RT-qPCR were employed to validate the differentially expressed genes associated with exhaustion. Results The second-generation CAR T cells targeting Trop2 were successfully constructed. Compared to the P-T group
in vitro
experiments demonstrated that these CAR T cells exhibited antigen-specific and dose-dependent cytotoxic effects against tumor cells with high Trop2 expression
such as MDA-MB-453 and SKOV3. A CAR-T cell exhaustion model established through repeated tumor antigen stimulation
in vitro
revealed that
compared to the initial state
the exhausted Trop2 CAR-T cells exhibited significantly reduced tumor-killing capacity while P-T cells showed almost no killing effect
the expression of inhibitory receptors (PD-1 and TIM-3) was up-regulated on the surface of exhausted CAR-T cells
and the secretion of effector cytokines was diminished. Transcriptomic analysis identified multiple differentially expressed genes in the exhausted CAR-T cells. Pathways related to immune response and T cell receptor signaling were down-regulated
while apoptosis-related pathways were activated. RT-qPCR further confirmed abnormal expression of immunoregulatory genes
including IL3
IL5
and IL13 (
P
<
0.05). Conclu
sion During continuous
in vitro
tumor antigen stimulation
the second-generation CAR-T cells targeting the Trop2 antigen demonstrate declined anti-tumor activity
weakened effector function and up-regulated expression of exhaustion-related molecules.
关键词
Keywords
references
李梦苑 ， 叶传涛 ， 张颖 ， 等 . 嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞免疫疗法在慢性病毒感染及其相关肿瘤中的研究进展 ［J］. 细胞与分子免疫学杂志 ， 2017 ， 33 （ 11 ）： 1567 - 1571 . DOI： 10.13423/j.cnki.cjcmi.008493 http://dx.doi.org/10.13423/j.cnki.cjcmi.008493 .
LI M Y ， YE C T ， ZHANG Y ， et al . Research progress of chimeric antigen receptor T（CAR-T） cell immunotherapy in chronic virus infection and related tumors ［J］. Chin J Cell Mol Immunol ， 2017 ， 33 （ 11 ）： 1567 - 1571 . DOI： 10.13423/j.cnki.cjcmi.008493 http://dx.doi.org/10.13423/j.cnki.cjcmi.008493 .
黄文鹏 ， 杨琦 ， 陈钊 ， 等 . 分子核医学在嵌合抗原受体T细胞免疫治疗的应用进展 ［J］. 中国医学物理学杂志 ， 2023 ， 40 （ 9 ）： 1057 - 1063 . DOI： 10.3969/j.issn.1005-202X.2023.09.001 http://dx.doi.org/10.3969/j.issn.1005-202X.2023.09.001 .
HUANG W P ， YANG Q ， CHEN Z ， et al . Advances in application of molecular nuclear medicine in chimeric antigen receptor T cell immunotherapy ［J］. Chin J Med Phys ， 2023 ， 40 （ 9 ）： 1057 - 1063 . DOI： 10.3969/j.issn.1005-202X.2023.09.001 http://dx.doi.org/10.3969/j.issn.1005-202X.2023.09.001 .
陈新峰 ， 刘莎莎 ， 张毅 . CAR-T细胞治疗的临床关键问题和对策 ［J］. 中国肿瘤生物治疗杂志 ， 2025 ， 32 （ 1 ）： 9 - 13 .
CHEN X F ， LIU S S ， ZHANG Y . Clinical key issues and countermeasures of CAR-T cell therapy ［J］. Chin J Cancer Biother ， 2025 ， 32 （ 1 ）： 9 - 13 .
ZHANG X M ， ZHU L L ， ZHANG H ， et al . CAR-T cell therapy in hematological malignancies： current opportunities and challenges ［J］. Front Immunol ， 2022 ， 13 ： 927153 . DOI： 10.3389/fimmu.2022.927153 http://dx.doi.org/10.3389/fimmu.2022.927153 .
D’AVANZO C ， BLAESCHKE F ， LYSANDROU M ， et al . Advances in cell therapy： progress and challenges in hematological and solid tumors ［J］. Trends Pharmacol Sci ， 2024 ， 45 （ 12 ）： 1119 - 1134 . DOI： 10.1016/j.tips.2024.10.016 http://dx.doi.org/10.1016/j.tips.2024.10.016 .
KASAKOVSKI D ， XU L ， LI Y Q . T cell senescence and CAR-T cell exhaustion in hematological malignancies ［J］. J Hematol Oncol ， 2018 ， 11 （ 1 ）： 91 . DOI： 10.1186/s13045-018-0629-x http://dx.doi.org/10.1186/s13045-018-0629-x .
莫馨霈 ， 李艳 ， 段勇 ， 等 . CAR-T细胞治疗肿瘤中T细胞耗竭现象的作用机制和策略 ［J］. 华中科技大学学报（医学版） ， 2024 ， 53 （ 5 ）： 705 - 712 .
MO X P ， LI Y ， DUAN Y ， et al . Mechanism and strategy of CAR-T cell therapy for T cell exhaustion in tumor ［J］. Acta Med Univ Sci Technol Huazhong ， 2024 ， 53 （ 5 ）： 705 - 712 .
李安娜 ， 江本元 ， 徐崇锐 ， 等 . 肺癌新型治疗方法： 机会与挑战 ［J］. 循证医学 ， 2025 ， 25 （ 1 ）： 1 - 18 .
LI A N ， JIANG B Y ， XU C R ， et al . Opportunities and challenges of new treatment strategy in non-small cell lung cancer ［J］. J Evid Based Med ， 2025 ， 25 （ 1 ）： 1 - 18 .
许杨悦 ， 马佩 ， 束永前 . 抗体偶联药物在肺癌靶向治疗中的临床研究进展 ［J］. 南京医科大学学报（自然科学版） ， 2025 ， 45 （ 1 ）： 98 - 104 .
XU Y Y ， MA P ， SHU Y Q . Research progress on antibody-drug conjugates in targeted therapy of lung cancer ［J］. J Nanjing Med Univ Nat Sci ， 2025 ， 45 （ 1 ）： 98 - 104 .
SOMBOONPATARAKUN C ， PHANTHAPHOL N ， SUWANCHIWASIRI K ， et al . Cytotoxicity of fourth-generation anti-Trop2 CAR-T cells against breast cancer ［J］. Int Immunopharmacol ， 2024 ， 129 ： 111631 . DOI： 10.1016/j.intimp.2024.111631 http://dx.doi.org/10.1016/j.intimp.2024.111631 .
ARGUETA S ， WANG Y X ， ZHAO H Y ， et al . In vivo programmed myeloid cells expressing novel chimeric antigen receptors show potent anti-tumor activity in preclinical solid tumor models ［J］. Front Immunol ， 2024 ， 15 ： 1501365 . DOI： 10.3389/fimmu.2024.1501365 http://dx.doi.org/10.3389/fimmu.2024.1501365 .
ZHU H J ， FANG X Y ， TUHIN I J ， et al . CAR T cells equipped with a fully human scFv targeting Trop2 can be used to treat pancreatic cancer ［J］. J Cancer Res Clin Oncol ， 2022 ， 148 （ 9 ）： 2261 - 2274 . DOI： 10.1007/s00432-022-04017-x http://dx.doi.org/10.1007/s00432-022-04017-x .
CHEN H P ， WEI F J ， YIN M ， et al . CD27 enhances the killing effect of CAR T cells targeting trophoblast cell surface antigen 2 in the treatment of solid tumors ［J］. Cancer Immunol Immunother ， 2021 ， 70 （ 7 ）： 2059 - 2071 . DOI： 10.1007/s00262-020-02838-8 http://dx.doi.org/10.1007/s00262-020-02838-8 .
WAHBY S ， FASHOYIN-AJE L ， OSGOOD C L ， et al . FDA approval summary： accelerated approval of sacituzumab govitecan-hziy for third-line treatment of metastatic triple-negative breast cancer ［J］. Clin Cancer Res ， 2021 ， 27 （ 7 ）： 1850 - 1854 . DOI： 10.1158/1078-0432.ccr-20-3119 http://dx.doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-20-3119 .
MCDOUGALL A R ， HOOPER S B ， ZAHRA V A ， et al . The oncogene Trop2 regulates fetal lung cell proliferation ［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol ， 2011 ， 301 （ 4 ）： L478 - L489 . DOI： 10.1152/ajplung.00063.2011 http://dx.doi.org/10.1152/ajplung.00063.2011 .
SHVARTSUR A ， BONAVIDA B . Trop2 and its overexpression in cancers： regulation and clinical/therapeutic implications ［J］. Genes Cancer ， 2015 ， 6 （ 3/4 ）： 84 - 105 . DOI： 10.18632/genesandcancer.40 http://dx.doi.org/10.18632/genesandcancer.40 .
蔡新培 ， 高锦莉 ， 徐芹芹 . 靶向Trop2 CAR-T治疗肺腺癌的研究进展 ［J］. 肿瘤药学 ， 2024 ， 14 （ 6 ）： 707 - 715 .
CAI X P ， GAO J L ， XU Q Q . Research progress of Trop2-targeted CAR-T in the treatment of lung adenocarcinoma ［J］. Anti Tumor Pharm ， 2024 ， 14 （ 6 ）： 707 - 715 .
HU Y ， ZHU Y ， QI D ， et al . Trop2-targeted therapy in breast cancer ［J］. Biomark Res ， 2024 ， 12 （ 1 ）： 82 . DOI： 10.1186/s40364-024-00633-6 http://dx.doi.org/10.1186/s40364-024-00633-6 .
YAO L ， CHEN J ， MA W . Decoding TROP2 in breast cancer： significance， clinical implications， and therapeutic advancements ［J］. Front Oncol ， 2023 ， 13 ： 1292211 . DOI： 10.3389/fonc.2023.1292211 http://dx.doi.org/10.3389/fonc.2023.1292211 .
马宜冬 ， 王真 ， 巩睿智 ， 等 . 靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞 ［J］. 第二军医大学学报 ， 2014 ， 35 （ 11 ）： 1177 - 1182 .
MA Y D ， WANG Z ， GONG R Z ， et al . Specific cytotoxicity of MUC1 chimeric antigen receptor-engineered Jurkat T cells against hepatocellular carcinoma ［J］. Acad J Second Mil Med Univ ， 2014 ， 35 （ 11 ）： 1177 - 1182 .
WILKIE S ， VAN SCHALKWYK M C I ， HOBBS S ， et al . Dual targeting of ErbB2 and MUC1 in breast cancer using chimeric antigen receptors engineered to provide complementary signaling ［J］. J Clin Immunol ， 2012 ， 32 （ 5 ）： 1059 - 1070 . DOI： 10.1007/s10875-012-9689-9 http://dx.doi.org/10.1007/s10875-012-9689-9 .
ROYBAL K T ， RUPP L J ， MORSUT L ， et al . Precision tumor recognition by T cells with combinatorial antigen-sensing circuits ［J］. Cell ， 2016 ， 164 （ 4 ）： 770 - 779 . DOI： 10.1016/j.cell.2016.01.011 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.01.011 .
SPRING L M ， TOLANEY S M ， FELL G ， et al . Response-guided neoadjuvant sacituzumab govitecan for localized triple-negative breast cancer： results from the NeoSTAR trial ［J］. Ann Oncol ， 2024 ， 35 （ 3 ）： 293 - 301 . DOI： 10.1016/j.annonc.2023.11.018 http://dx.doi.org/10.1016/j.annonc.2023.11.018 .
GRAY J E ， HEIST R S ， STARODUB A N ， et al . Therapy of small cell lung cancer （SCLC） with a topoisomerase- I-inhibiting antibody-drug conjugate （ADC） targeting trop-2， sacituzumab govitecan ［J］. Clin Cancer Res ， 2017 ， 23 （ 19 ）： 5711 - 5719 . DOI： 10.1158/1078-0432.CCR-17-0933 http://dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-17-0933 .
CURDY N ， LANVIN O ， LAURENT C ， et al . Regulatory mechanisms of inhibitory immune checkpoint receptors expression ［J］. Trends Cell Biol ， 2019 ， 29 （ 10 ）： 777 - 790 . DOI： 10.1016/j.tcb.2019.07.002 http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2019.07.002 .
CHOW A ， PERICA K ， KLEBANOFF C A ， et al . Clinical implications of T cell exhaustion for cancer immunotherapy ［J］. Nat Rev Clin Oncol ， 2022 ， 19 （ 12 ）： 775 - 790 . DOI： 10.1038/s41571-022-00689-z http://dx.doi.org/10.1038/s41571-022-00689-z .
0
Views
0
下载量
0
CSCD
- L-PDFDownload
- WORDDownload
- Meta-XMLDownload
- BibTeXDownload
- EndnoteDownload
- RefMan Download
- NoteExpressDownload
- NoteFirstDownload
Publicity Resources
Related Articles
Related Author
Related Institution
- Technical support is provided by Beijing Founder electronics co., LTD 京ICP备09064830号-19
京公网安备11010802024621 - It is recommended to read the content of this site in Chrome&IE9+. Please switch to extreme mode in browser 360.
- Cookies We use cookies to help provide and enhance our service and tailor content. By continuing, you agree to the use of cookies.
