RANKL通过ROS介导HIF-1α下调促进自噬和破骨细胞分化

LI Songtao; SUN Jing; CHU Tongwei

doi:10.16016/j.2097-0927.202502048

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RANKL通过ROS介导HIF-1α下调促进自噬和破骨细胞分化

Basic Medicine | 更新时间：2025-04-25

- RANKL通过ROS介导HIF-1α下调促进自噬和破骨细胞分化
- Journal of Army Medical University Vol. 47, Issue 8, Pages: 816-825(2025)
- 作者机构：
  
  1.陆军军医大学（第三军医大学）第二附属医院骨科，重庆
  2.中国人民解放军总医院第九医疗中心脊柱外科，北京
- 作者简介：
  
  CHU Tongwei， E-mail： chtw@sina.com
- 基金信息：
  
  the Chongqing Talent Program(CQYC2020020347)
- DOI：10.16016/j.2097-0927.202502048
  CLC： R322.71;R329.28;R394.2
- Received：17 February 2025，
  
  Revised：02 March 2025，
  
  Published：30 April 2025
- 稿件说明：
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李松涛,孙靖,初同伟.RANKL通过ROS介导HIF-1α下调促进自噬和破骨细胞分化[J].陆军军医大学学报,2025,47(08):816-825.

LI Songtao,SUN Jing,CHU Tongwei.RANKL drives autophagy and osteoclast differentiation via ROS-mediated HIF-1α down-regulation[J].J Army Med Univ,2025,47(08):816-825.
李松涛,孙靖,初同伟.RANKL通过ROS介导HIF-1α下调促进自噬和破骨细胞分化[J].陆军军医大学学报,2025,47(08):816-825. DOI：10.16016/j.2097-0927.202502048.

LI Songtao,SUN Jing,CHU Tongwei.RANKL drives autophagy and osteoclast differentiation via ROS-mediated HIF-1α down-regulation[J].J Army Med Univ,2025,47(08):816-825. DOI：10.16016/j.2097-0927.202502048.

摘要

目的

探究核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL）通过ROS-HIF-1α信号轴调控自噬和破骨细胞分化的分子机制。

方法

以RAW264.7小鼠单核/巨噬细胞系为模型，采用随机数字表法将细胞分为Control组、RANKL组及联合干预组［RANKL+CQ组（自噬抑制剂干预）、RANKL+FG-4592组（HIF-1α稳定剂干预）、RANKL+NAC组（ROS清除剂干预）］。通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色定量检测成熟多核破骨细胞数量；Western blot检测HIF-1α、LC3蛋白表达水平；qRT-PCR分析破骨细胞分化相关基因（

TRAP、Cath K

和

MMP-9

）mRNA表达水平；基于腺病毒mRFP-GFP-LC3标记系统结合激光共聚焦显微镜观察自噬通量活性；DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（ROS）水平。

结果

与Control组相比，RANKL组中TRAP阳性多核破骨细胞数量显著增加（

0.05），破骨细胞分化相关基因mRNA表达水平明显上调；同时激活自噬通路，表现为LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（

0.05）及自噬溶酶体数量增加（

0.05）；细胞内ROS水平显著升高（

0.05），且HIF-1α蛋白表达下调（

0.05）。与RANKL组比较，RANKL+NAC组显著抑制细胞内ROS蓄积（

0.05），并逆转HIF-1α蛋白的低表达（

0.05）；同时降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（

0.05）及自噬通量活性（

0.05）；伴随破骨细胞分化相关基因表达水平下降（

0.05）及成熟破骨细胞数量减少（

0.05）。与RANKL组比较，RANKL+FG-4592组明显提升HIF-1α蛋白表达水平（

0.05）；同时抑制自噬激活［LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（

0.05）；自噬通量活性减少（

0.05）］，进而减少破骨细胞分化相关基因表达（

0.05）及成熟破骨细胞数量（

0.05）。与RANKL组比较，RANKL+CQ组显著抑制自噬通量活性（

0.05）；同时明显减少破骨细胞分化相关基因表达水平（

0.05）及成熟破骨细胞数量（

0.05）。

结论

RANKL通过ROS介导的HIF-1α下调激活自噬，促进破骨细胞分化。

Abstract

‍Ob

jective‍　‍To investigate the molecular mechanism by which receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) regulates autophagy and osteoclast differentiation through the ROS-HIF-1α signaling axis. Methods‍　‍Mouse monocytic/macrophage RAW264.7 cells were randomly divided into control group

RANKL group

and 3 combined intervention groups

that is

RANKL+CQ group (intervention with autophagy inhibitor

CQ)

RANKL+FG-4592 group (intervention with HIF-1α stabilizer

FG-4592)

and RANKL+NAC group (intervention with ROS scavenger

NAC). The number of mature multinucleated osteoclasts was quantitatively detected with tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining; the protein levels of HIF-1α and LC3 were detected by Western blotting and the mRNA levels of osteoclast differentiation-related genes (

TRAP

Cath K

and

MMP-9

) were analyzed by qRT-PCR; autophagy flux and activity were observed by adenovirus mRFP-GFP-LC3 labeling system combined with confocal laser microscopy; and the production of intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured by DCFH-DA probe. Results‍　‍Compared with the control group

the RANKL group obtained significantly increased number of TRAP-positive multinucleated osteoclasts (

0.05)

up-regulated mRNA levels of osteoclast differentiation-related genes

activated autophagy pathway

as evidenced by the increased LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio (

0.05) and number of autophagic lysosomes (

0.05)

elevated intracellular ROS generation (

0.05)

and down-regulated HIF-1α protein level (

0.05). NAC intervention significantly inhibited intracellular ROS accumulation (

0.05)

reversed the lowered expression of HIF-1α protein (

0.05)

decreased the LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio (

0.05) and autophagy flux and activity (

0.05)

and reduced expression levels of osteoclast differenti

ation-related genes and the number of mature osteoclasts (

0.05). In the RANKL+FG-4592 group

HIF-1α protein level was significantly increased (

0.05)

autophagy activation was inhibited [with decreased LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio (

0.05) and autophagy flux and activity (

0.05)

]

and the expression of osteoclast differentiation-related genes and number of mature osteoclasts were decreased (

0.05) when compared with the RANKL group. While CQ treatment resulted in inhibited autophagy flux and activity (

0.05)

declined expression levels of osteoclast differentiation-related genes

and reduced number of mature osteoclasts (

0.05). Conclusion‍　‍RANKL activates autophagy through ROS-mediated down-regulation of HIF-1α

and thereby promotes osteoclast differentiation.

关键词

Keywords

references

UPADHYAY J ， FARR O M ， MANTZOROS C S . The role of leptin in regulating bone metabolism ［J］. Metabolism ， 2015 ， 64 （ 1 ）： 105 - 113 . DOI： 10.1016/j.metabol.2014.10.021 http://dx.doi.org/10.1016/j.metabol.2014.10.021 .

JACOME-GALARZA C E ， PERCIN G I ， MULLER J T ， et al . Developmental origin， functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts ［J］. Nature ， 2019 ， 568 （ 7753 ）： 541 - 545 . DOI： 10.1038/s41586-019-1105-7 http://dx.doi.org/10.1038/s41586-019-1105-7 .

JOHNSON R W ， SCHIPANI E ， GIACCIA A J . HIF targets in bone remodeling and metastatic disease ［J］. Pharmacol Ther ， 2015 ， 150 ： 169 - 177 . DOI： 10.1016/j.pharmthera. 2015. 02.002 http://dx.doi.org/10.1016/j.pharmthera.2015.02.002 .

OIKAWA T ， KURODA Y ， MATSUO K . Regulation of osteoclasts by membrane-derived lipid mediators ［J］. Cell Mol Life Sci ， 2013 ， 70 （ 18 ）： 3341 - 3353 . DOI： 10.1007/s00018-012-1238-4 http://dx.doi.org/10.1007/s00018-012-1238-4 .

XU F ， TEITELBAUM S L . Osteoclasts： new insights ［J］. Bone Res ， 2013 ， 1 （ 1 ）： 11 - 26 . DOI： 10.4248/BR201301003 http://dx.doi.org/10.4248/BR201301003 .

KIMURA K ， KITAURA H ， FUJII T ， et al . An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model ［J］. Oral Dis ， 2014 ， 20 （ 3 ）： 319 - 324 . DOI： 10.1111/odi.12117 http://dx.doi.org/10.1111/odi.12117 .

PI H ， XU S ， REITER R J ， et al . SIRT3-SOD2-mROS-dependent autophagy in cadmium-induced hepatotoxicity and salvage by melatonin ［J］. Autophagy ， 2015 ， 11 （ 7 ）： 1037 - 1051 . DOI： 10.1080/15548627.2015.1052208 http://dx.doi.org/10.1080/15548627.2015.1052208 .

KIM K H ， LEE M S . Autophagy： a key player in cellular and body metabolism ［J］. Nat Rev Endocrinol ， 2014 ， 10 （ 6 ）： 322 - 337 . DOI： 10.1038/nrendo.2014.35 http://dx.doi.org/10.1038/nrendo.2014.35 .

HU Y X ， HAN X S ， JING Q . Autophagy in development and differentiation ［J］. Adv Exp Med Biol ， 2019 ， 1206 ： 469 - 487 . DOI： 10.1007/978-981-15-0602-4_22 http://dx.doi.org/10.1007/978-981-15-0602-4_22 .

唐梦灵，胡治强，袁思琪，等 . 类鼻疽杆菌通过抑制自噬调控HepG2细胞胞内脂质代谢［J］. 第三军医大学学报， 2019 ， 41 （ 18 ）： 1722 - 1729 . DOI： 10.16016/j.1000-5404.201906061 http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201906061 .

TANG M L ， HU Z Q ， YUAN S Q ， et al . Burkholderia pseudomallei regulates lipid metabolism in HepG2 cells by inducing autophagy suppression ［J］. J Third Mil Med Univ ， 2019 ， 41 （ 18 ）： 1722 - 1729 . DOI： 10.16016/j.1000-5404.201906061 http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201906061 .

SAMBANDAM Y ， TOWNSEND M T ， PIERCE J J ， et al . Microgravity control of autophagy modulates osteoclasto- genesis ［J］. Bone ， 2014 ， 61 ： 125 - 131 . DOI： 10.1016/j.bone.2014.01.004 http://dx.doi.org/10.1016/j.bone.2014.01.004 .

SHI J ， WANG L ， ZHANG H ， et al . Glucocorticoids： Dose-related effects on osteoclast formation and function via reactive oxygen species and autophagy ［J］. Bone ， 2015 ， 79 ： 222 - 232 . DOI： 10.1016/j.bone.2015.06.014 http://dx.doi.org/10.1016/j.bone.2015.06.014 .

DESELM C J ， MILLER B C ， ZOU W ， et al . Autophagy proteins regulate the secretory component of osteoclastic bone resorption ［J］. Dev Cell ， 2011 ， 21 （ 5 ）： 966 - 974 . DOI： 10.1016/j.devcel.2011.08.016 http://dx.doi.org/10.1016/j.devcel.2011.08.016 .

WANG J ， ZHANG Y ， CAO J ， et al . The role of autophagy in bone metabolism and clinical significance ［J］. Autophagy ， 2023 ， 19 （ 9 ）： 2409 - 2427 . DOI： 10.1080/15548627.2023.2186112 http://dx.doi.org/10.1080/15548627.2023.2186112 .

RASHID M ， ZADEH L R ， BARADARAN B ， et al . Up-down regulation of HIF-1α in cancer progression ［J］. Gene ， 2021 ， 798 ： 145796 . DOI： 10.1016/j.gene.2021.145796 http://dx.doi.org/10.1016/j.gene.2021.145796 .

SEMENZA G L . Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine ［J］. Cell ， 2012 ， 148 （ 3 ）： 399 - 408 . DOI： 10.1016/j.cell.2012.01.021 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2012.01.021 .

SUN J ， CHEN W G ， LI S T ， et al . Nox4 promotes RANKL-induced autophagy and osteoclastogenesis via activating ROS/PERK/eIF-2α/ATF4 pathway ［J］. Front Pharmacol ， 2021 ， 12 ： 751845 . DOI： 10.3389/fphar.2021.751845 http://dx.doi.org/10.3389/fphar.2021.751845 .

ZHANG T ， GUO S ， ZHU X Y ， et al . Alpinetin inhibits breast cancer growth by ROS/NF-κB/HIF-1α axis ［J］. J Cell Mol Med ， 2020 ， 24 （ 15 ）： 8430 - 8440 . DOI： 10.1111/jcmm.15371 http://dx.doi.org/10.1111/jcmm.15371 .

BAE T ， HALLIS S P ， KWAK M K . Hypoxia， oxidative stress， and the interplay of HIFs and NRF2 signaling in cancer ［J］. Exp Mol Med ， 2024 ， 56 （ 3 ）： 501 - 514 . DOI： 10.1038/s12276-024-01180-8 http://dx.doi.org/10.1038/s12276-024-01180-8 .

JANBANDHU V ， TALLAPRAGADA V ， PATRICK R ， et al . HIF-1a suppresses ROS-induced proliferation of cardiac fibroblasts following myocardial infarction ［J］. Cell Stem Cell ， 2022 ， 29 （ 2 ）： 281 - 297.e12 . DOI： 10.1016/j.stem.2021.10.009 http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2021.10.009 .

SHAPIRO I M ， LAYFIELD R ， LOTZ M ， et al . Boning up on autophagy： the role of autophagy in skeletal biology ［J］. Autophagy ， 2014 ， 10 （ 1 ）： 7 - 19 . DOI： 10.4161/auto.26679 http://dx.doi.org/10.4161/auto.26679 .

SU B H ， LI D ， XU J ， et al . Wear particles enhance autophagy through up-regulation of CD147 to promote osteoclastogenesis ［J］. Iran J Basic Med Sci ， 2018 ， 21 （ 8 ）： 806 - 812 . DOI： 10.22038/IJBMS.2018.29347.7093 http://dx.doi.org/10.22038/IJBMS.2018.29347.7093 .

ZHAO S J ， KONG F Q ， CAI W ， et al . GIT1 contributes to autophagy in osteoclast through disruption of the binding of Beclin1 and Bcl2 under starvation condition ［J］. Cell Death Dis ， 2018 ， 9 （ 12 ）： 1195 . DOI： 10.1038/s41419-018-1256-8 http://dx.doi.org/10.1038/s41419-018-1256-8 .

DAHIYA N ， KHADKA A ， SHARMA A K ， et al . Denosumab： a bone antiresorptive drug ［J］. Med J Armed Forces India ， 2015 ， 71 （ 1 ）： 71 - 75 . DOI： 10.1016/j.mjafi.2014.02.001 http://dx.doi.org/10.1016/j.mjafi.2014.02.001 .

FU Z J ， WANG Z Y ， XU L ， et al . HIF-1α-BNIP3-mediated mitophagy in tubular cells protects against renal ischemia/reperfusion injury ［J］. Redox Biol ， 2020 ， 36 ： 101671 . DOI： 10.1016/j.redox.2020.101671 http://dx.doi.org/10.1016/j.redox.2020.101671 .

LU N ， LI X X ， TAN R L ， et al . HIF-1α/Beclin1-mediated autophagy is involved in neuroprotection induced by hypoxic preconditioning ［J］. J Mol Neurosci ， 2018 ， 66 （ 2 ）： 238 - 250 . DOI： 10.1007/s12031-018-1162-7 http://dx.doi.org/10.1007/s12031-018-1162-7 .

HERB M ， SCHRAMM M . Functions of ROS in macrophages and antimicrobial immunity ［J］. Antioxidants （Basel）， 2021 ， 10 （ 2 ）： 313 . DOI： 10.3390/antiox10020313 http://dx.doi.org/10.3390/antiox10020313 .

LI X Q ， FAN Z . The epidermal growth factor receptor antibody cetuximab induces autophagy in cancer cells by downregulating HIF-1alpha and Bcl-2 and activating the beclin 1/hVps34 complex ［J］. Cancer Res ， 2010 ， 70 （ 14 ）： 5942 - 5952 . DOI： 10.1158/0008-5472.CAN-10-0157 http://dx.doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-10-0157 .

MOLONEY J N ， COTTER T G . ROS signalling in the biology of cancer ［J］. Semin Cell Dev Biol ， 2018 ， 80 ： 50 - 64 . DOI： 10.1016/j.semcdb.2017.05.023 http://dx.doi.org/10.1016/j.semcdb.2017.05.023 .

SUN B ， YU L ， XU C ， et al . NAD（P）HX epimerase downregulation promotes tumor progression through ROS/HIF-1α signaling in hepatocellular carcinoma ［J］. Cancer Sci ， 2021 ， 112 （ 7 ）： 2753 - 2769 . DOI： 10.1111/cas.14925 http://dx.doi.org/10.1111/cas.14925 .

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