m6A demethylase
FTO rgulates BCL2 mRNA stability and translation efficiency and thereby promotes proplatelet formation- Journal of Army Medical University Vol. 47, Issue 6, Pages: 519-530(2025)
- 作者机构：
1.川北医学院基础医学与法医学院病理生理学教研室，四川南充
2.陆军特色医学中心（第三军医大学大坪医院）输血医学科，创伤与化学中毒全国重点实验室，重庆
- 作者简介：
CHEN Wei， E-mail： chengwei197959@163.com； WEN Aiqing， E-mail： wenaiqing@tmmu.edu.cn
- 基金信息：the General Program of National Natural Science Foundation of China(82170134)
DOI：10.16016/j.2097-0927.202412047
CLC： R329.25;R331.143;R394.3Received：10 December 2024，
Revised：14 February 2025，
Published：30 March 2025
- 稿件说明：
移动端阅览
夏文军，卢尧，吴煌，等.m6A去甲基化酶FTO调控BCL2 mRNA稳定性与翻译效率促进血小板前体形成［J］.陆军军医大学学报，2025，47（06）：519-530.DOI：10.16016/j.2097-0927.202412047.
XIA W J， LU Y， WU H， et al.m6A demethylase FTO rgulates BCL2 mRNA stability and translation efficiency to promote proplatelet formation［J］.J Army Med Univ，2025，47（06）：519-530.DOI：10.16016/j.2097-0927.202412047.
夏文军，卢尧，吴煌，等.m6A去甲基化酶FTO调控BCL2 mRNA稳定性与翻译效率促进血小板前体形成［J］.陆军军医大学学报，2025，47（06）：519-530.DOI：10.16016/j.2097-0927.202412047. DOI：
XIA W J， LU Y， WU H， et al.m6A demethylase FTO rgulates BCL2 mRNA stability and translation efficiency to promote proplatelet formation［J］.J Army Med Univ，2025，47（06）：519-530.DOI：10.16016/j.2097-0927.202412047. DOI：
摘要
目的
2
探究下调m
6
A去甲基化酶脂肪质量和肥胖相关基因（fat mass and obesity-associated protein ，
FTO
）对MEG-01巨核细胞系血小板前体形成的影响及其机制。
方法
2
①分别用1 nmol/L 佛波迷酯（phorbol myristate acetate，PMA）组（诱导组）和DMSO组（对照组）处理MEG-01细胞 72 h，通过Western blot和RT-qPCR检测FTO蛋白和mRNA表达变化情况。②用靶向
FTO
的病毒液（sh-FTO）和阴性对照病毒液（sh-NC）感染MEG-01细胞，用1 nmol/L PMA诱导sh-NC组和sh-FTO组MEG-01细胞72 h后，Western blot和RT-qPCR检测FTO蛋白和mRNA表达变化情况。碘化丙啶（propidium lodrde， PI）DNA染色检测细胞周期、CCK-8检测细胞活力，Annexin V-F
ITC/PI双染、TUNEL染色检测细胞凋亡情况，Western blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达量，CD41/CD61染色检测巨核细胞成熟情况，明场观察和CD61免疫荧光检测血小板前体形成情况，RT-qPCR检测细胞凋亡相关分子（
Caspase
-
3
、
BAD
、
BAK1
、
BCL2
、
MCL1
）表达量，Western blot检测进一步验证BCL2蛋白变化情况，基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）中筛选出数据集；使用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器（University of California， Santa Cruz genome browser，UCSC）分析比对BCL2 mRNA上的甲基化测序峰；m
6
A甲基化RNA免疫共沉淀（m
6
A RNA immunoprecipitation， m
6
A-RIP）验证MEG-01巨核细胞BCL2 mRNA m
6
A甲基化富集水平，检测sh-NC组和sh-FTO组BCL2 mRNA m
6
A甲基化富集水平变化，以mRNA 半衰期实验和多聚核糖体分离实验检测BCL2 mRNA翻译效率。
结果
2
①与DMSO组相比，PMA 组FTO蛋白（
P
<
0.05）和 mRNA（
P
<
0.01）表达水平升高；②与sh-NC组相比，sh-FTO组 FTO mRNA和蛋白表达水平明显降低（
P
<
0.01），细胞周期发生G1/S期阻滞［（60.80±1.29）%
vs
（72.13±1.18）%，
P
<
0.01］，细胞活力明显降低［（1.17±0.03）%
vs
（0.69±0.05）%，
P
<
0.05］，Annexin V-FITC/PI阳性细胞占比升高［（12.87±0.83）%
vs
（17.45±1.58）%，
P
<
0.01］，TUNEL 阳性细胞占比显著升高［（1.03±0.27）%
vs
（17.49±9.91）%，
P
<
0.01］，cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高（
P
<
0.01），CD41
+
CD61
+
阳性率明显降低［（51.63±1.13）%
vs
（34.08±0.53）%，
P
<
0.01］，具有伪足的巨核细胞比率明显降低［（26.49±6.73）%
vs
（13.31±5.97）%，
P
<
0.01］。③与sh-NC相比，sh-FTO组细胞抗凋亡分子BCL2蛋白和mRNA表达水平显著降低（
P
<
0.01），UCSC GEO测序显示BCL2 mRNA上有m
6
A甲基化修饰位点，并经m
6
A-RIP实验在MEG-01巨核细胞验证：与GAPDH mRNA相比，BCL2 mRNA有明显的m
6
A富集信号（
P
<
0.01）；与sh-NC相比， BCL2 mRNA上的m
6
A甲基化修饰明显升高（
P
<
0.01）；BCL2 mRNA的稳定性显著降低，翻译效率显著降低（
P
<
0.01）。
结论
2
m6A去甲基化酶FTO调控BCL2 mRNA稳定性与翻译效率，促进血小板前体形成。
Abstract
Objective To investigate the effects and underlying mechanisms of
down-regulating m
6
A demethylase fat mass and obesity-associated protein (
FTO
) on proplatelet formation in the MEG-01 megakaryocytic cells. Methods ①MEG-01 cells were treated with 1 nmol/L phorbol myristate acetate (PMA) (treatment group) or DMSO (control group) for 72 h. FTO expression was measured by Western blotting and RT-qPCR. ② MEG-01 cells were infected with targeted FTO shRNA (knockdown group
sh-FTO) or negative control shRNA (negative control group
sh-NC) viruses. FTO knockdown group and negative control group MEG-1 cells were treated with 1 nmol/L PMA for 72 h
and the protein and mRNA expression levels of FTO were detected by Western blotting and RT-qPCR. Cell cycle
viability and apoptosis were assessed by propidium iodide (PI) DNA staining
CCK-8 assay and Annexin V-FITC/PI double staining and TUNEL staining. The expression of cleaved Caspase-3 protein was determine by Western blotting. Megakaryocyte maturation was assessed by CD41/CD61 staining. Proplatelet formation was observed under bright field and detected by CD61 immunofluorescence assay. The expression of apoptosis-related molecules (
Caspase3
BAD
BAK1
BCL2
and
MCL1
) was detected by RT-qPCR
and the protein change of BCL2 was further verified by Western blotting. The dataset was screened out from the gene expression omnibus (GEO) database
and then analyzed with University of California
Santa Cruz (UCSC) genome browser to compare the methylation sequencing peaks on BCL2 mRNA
and m
6
A methylated RNA immunoprecipitation (m
6
A-RIP) was used to assess the m
6
A methylation levels of BCL2 target gene mRNAs in MEG-01 megakaryocytes. Then
the changes in the m
6
A methylation enrichment level of BCL2 mRNA were observed between the sh-NC group and the sh-FTO group. mRNA stability and ribosome profiling assays were performed to assess translational efficiency of target genes. Results ①PMA treatment upregulated the expression of FTO at protein (
P
<
0.05) and mRNA (
P
<
0.01) levels. ② FTO shRNA resulted in reduced FTO expression at both mRNA and protein levels (
P
<
0.01). Compared to the negative control group
the FTO knockdown group showed more cells arrested at the G1/S phase [(60.80±1.29)%
vs
(72.13±1.18)%
P
<
0.01
]
significantly reduced cell viability [(1.17±0.03)%
vs
(0.69±0.05)%
P
<
0.01
]
increased Annexin V-FITC/PI positive cells [(12.87±0.83)%
vs
(17.45±1.58)%
P
<
0.01
]
more TUNEL positive cells [(1.03±0.27)%
vs
(17.49±9.91)%
P
<
0.01
]
enhanced protein level of cleaved Caspase-3 (
P
<
0.01)
decreased proportion of CD41/CD61 positive cells [(51.63±1.13)%
vs
(34.08±0.53)%
P
<
0.01
]
and less proplatelet formation in MEG-01 megakaryocytes [(26.49±6.73)%
vs
(13.31±5.97)%
P
<
0.01
]
. ③Compared to sh-NC group
the FTO knockdown group had significantly decreased protein and mRNA expression of anti-apoptotic molecule BCL2 (
P
<
0.01). UCSC GEO sequencing data revealed there were m
6
A methylation modification sites on BCL2 mRNA
which was verified through m
6
A-RIP experiment in MEG-01 megakaryocytes. Compared with GAPDH mRNA
BCL2 mRNA exhibited a significantly enriched m
6
A signal (
P
<
0.01). Compared to sh-NC group
a significant increase in m
6
A methylation modification was observed on BCL2 mRNA. BCL2 mRNA stability was significantly decreased
and its translation efficiency significantly was decreased
(
P
<
0.01). Conclusion m
6
A demethylase
FTO
rgulates BCL2 mRNA stability and translation efficiency，thereby promoting proplatelet formation in MEG-01 megakaryocytes.
关键词
Keywords
references
SCHLESINGER M . Role of platelets and platelet receptors in cancer metastasis ［J］. J Hematol Oncol ， 2018 ， 11 （ 1 ）： 125 . DOI： 10.1186/s13045-018-0669-2 http://dx.doi.org/10.1186/s13045-018-0669-2 .
ROWETH H G ， BATTINELLI E M . Lessons to learn from tumor-educated platelets ［J］. Blood ， 2021 ， 137 （ 23 ）： 3174 - 3180 . DOI： 10.1182/blood.2019003976 http://dx.doi.org/10.1182/blood.2019003976 .
VAN DER MEIJDEN P E J ， HEEMSKERK J W M . Platelet biology and functions： new concepts and clinical perspectives ［J］. Nat Rev Cardiol ， 2019 ， 16 ： 166 - 179 . DOI： 10.1038/s41569-018-0110-0 http://dx.doi.org/10.1038/s41569-018-0110-0 .
FURNISS J A ， TARASSOVA N ， POOLE A W . Platelet generation in vivo and in vitro ［J］. Blood ， 2024 ， 144 （ 22 ）： 2283 - 2294 . DOI： 10.1182/blood.2024024601 http://dx.doi.org/10.1182/blood.2024024601 .
GREMMEL T ， 3rd FRELINGER A L ， MICHELSON A D . Platelet Physiology ［J］. Semin Thromb Hemost ， 2016 ， 42 （ 3 ）： 191 - 204 . DOI： 10.1055/s-0035-1564835 http://dx.doi.org/10.1055/s-0035-1564835 .
ALWAN F ， VENDRAMIN C ， LIESNER R ， et al . Characterization and treatment of congenital thrombotic thrombocytopenic Purpura ［J］. Blood ， 2019 ， 133 （ 15 ）： 1644 - 1651 . DOI： 10.1182/blood-2018-11-884700 http://dx.doi.org/10.1182/blood-2018-11-884700 .
QIAN P ， WILLCOX A ， CLIFF E R S . Thrombotic complications of immune thrombocytopenic Purpura ［J］. Lancet Haematol ， 2024 ， 11 （ 3 ）： e240 . DOI： 10.1016/s2352-3026（23）00370-8 http://dx.doi.org/10.1016/s2352-3026（23）00370-8 .
LEONE M ， NIELSEN N D ， RUSSELL L . Ten tips on sepsis-induced thrombocytopenia ［J］. Intensive Care Med ， 2024 ， 50 （ 7 ）： 1157 - 1160 . DOI： 10.1007/s00134-024-07478-5 http://dx.doi.org/10.1007/s00134-024-07478-5 .
GODFREY A L ， GREEN A C ， HARRISON C N . Essential thrombocythemia： challenges in clinical practice and future prospects ［J］. Blood ， 2023 ， 141 （ 16 ）： 1943 - 1953 . DOI： 10.1182/blood.2022017625 http://dx.doi.org/10.1182/blood.2022017625 .
ETO K ， KUNISHIMA S . Linkage between the mechanisms of thrombocytopenia and thrombopoiesis ［J］. Blood ， 2016 ， 127 （ 10 ）： 1234 - 1241 . DOI： 10.1182/blood-2015-07-607903 http://dx.doi.org/10.1182/blood-2015-07-607903 .
JIANG X L ， LIU B Y ， NIE Z ， et al . The role of m 6 A modification in the biological functions and diseases ［J］. Signal Transduct Target Ther ， 2021 ， 6 ： 74 . DOI： 10.1038/s41392-020-00450-x http://dx.doi.org/10.1038/s41392-020-00450-x .
AN Y ， DUAN H . The role of m 6 A RNA methylation in cancer metabolism ［J］. Mol Cancer ， 2022 ， 21 （ 1 ）： 14 . DOI： 10.1186/s12943-022-01500-4 http://dx.doi.org/10.1186/s12943-022-01500-4 .
ZHANG H ， SHI X R ， HUANG T ， et al . Dynamic landscape and evolution of m 6 A methylation in human ［J］. Nucleic Acids Res ， 2020 ， 48 （ 11 ）： 6251 - 6264 . DOI： 10.1093/nar/gkaa347 http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkaa347 .
LI Y C ， SU R ， DENG X L ， et al . FTO in cancer： functions， molecular mechanisms， and therapeutic implications ［J］. Trends Cancer ， 2022 ， 8 （ 7 ）： 598 - 614 . DOI： 10.1016/j.trecan.2022.02.010 http://dx.doi.org/10.1016/j.trecan.2022.02.010 .
ZACCARA S ， RIES R J ， JAFFREY S R . Publisher correction： reading， writing and erasing mRNA methylation ［J］. Nat Rev Mol Cell Biol ， 2023 ， 24 ： 770 . DOI： 10.1038/s41580-023-00654-3 http://dx.doi.org/10.1038/s41580-023-00654-3 .
CHENG Y M ， LUO H Z ， IZZO F ， et al . m 6 A RNA methylation maintains hematopoietic stem cell identity and symmetric commitment ［J］. Cell Rep ， 2019 ， 28 （ 7 ）： 1703 - 1716.e6 . DOI： 10.1016/j.celrep.2019.07.032 http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2019.07.032 .
LEE H ， BAO S Y ， QIAN Y Z ， et al . Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m 6 A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation ［J］. Nat Cell Biol ， 2019 ， 21 ： 700 - 709 . DOI： 10.1038/s41556-019-0318-1 http://dx.doi.org/10.1038/s41556-019-0318-1 .
WEI J ， YU X ， YANG L ， et al . FTO mediates LINE1 m 6 A demethylation and chromatin regulation in mE SCs and mouse development ［J］. Science ， 2022 ， 376 （ 6596 ）： 968 - 973 . DOI： 10.1126/science.abe9582 http://dx.doi.org/10.1126/science.abe9582 .
WANG X P ， COOPER S ， BROXMEYER H E ， et al . Transient regulation of RNA methylation in human hematopoietic stem cells promotes their homing and engraftment ［J］. Leukemia ， 2023 ， 37 ： 453 - 464 . DOI： 10.1038/s41375-022-01761-4 http://dx.doi.org/10.1038/s41375-022-01761-4 .
全军重症医学专业委员会 ， 中华医学会检验医学分会 . 中国成人重症患者血小板减少诊疗专家共识 ［J］. 解放军医学杂志 ， 2020 ， 45 （ 5 ）： 457 - 474 . DOI： 10.11855/j.issn.0577-7402.2020.05.01 http://dx.doi.org/10.11855/j.issn.0577-7402.2020.05.01 .
Critical Care Medicine Committee of Chinese PLA and Chinese Society of Laboratory Medicine ， Chinese Medical Association . Expert consensus for diagnosis and treatment of thrombocytopenia in adult critical illness in China ［J］. Med J Chin PLA ， 2020 ， 45 （ 5 ）： 457 - 474 . DOI： 10.11855/j.issn.0577-7402.2020.05.01 http://dx.doi.org/10.11855/j.issn.0577-7402.2020.05.01 .
JIANG H J ， YU Z ， DING N ， et al . The role of AGK in thrombocytopoiesis and possible therapeutic strategies ［J］. Blood ， 2020 ， 136 （ 1 ）： 119 - 129 . DOI： 10.1182/blood. 2019003851 http://dx.doi.org/10.1182/blood.2019003851 .
XU B ， YE X ， WEN Z ， et al . Epigenetic regulation of megakaryopoiesis and platelet formation ［J］. Haematologica ， 2024 ， 109 （ 10 ）： 3125 - 3137 . DOI： 10.3324/haematol.2023.284951 http://dx.doi.org/10.3324/haematol.2023.284951 .
ZACCARA S ， RIES R J ， JAFFREY S R . Reading， writing and erasing mRNA methylation ［J］. Nat Rev Mol Cell Biol ， 2019 ， 20 ： 608 - 624 . DOI： 10.1038/s41580-019-0168-5 http://dx.doi.org/10.1038/s41580-019-0168-5 .
白秦 ， 陈燕华 ， 卢尧 ， 等 . 下调METTL3-LYN m 6 A -IGF2BP2通路抑制内皮细胞迁移 ［J］. 第三军医大学学报 ， 2021 ， 43 （ 9 ）： 845 - 851 . DOI： 10.16016/j.1000-5404.202011144 http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.202011144 .
BAI Q ， CHEN Y H ， LU Y ， et al . Down-regulation of METTL3-LYN m 6 A -IGF2BP2 pathway inhibits endothelial cell migration ［J］. J Third Mil Med Univ ， 2021 ， 43 （ 9 ）： 845 - 851 . DOI： 10.16016/j.1000-5404.202011144 http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.202011144 .
CHEN X ， YUAN Y ， ZHOU F ， et al . RNA modification in normal hematopoiesis and hematologic malignancies ［J］. MedComm （2020）， 2024 ， 5 （ 11 ）： e787 . DOI： 10.1002/mco2.787 http://dx.doi.org/10.1002/mco2.787 .
SMEMO S ， TENA J J ， KIM K H ， et al . Obesity-associated variants within FTO form long-range functional connections with IRX3 ［J］. Nature ， 2014 ， 507 ： 371 - 375 . DOI： 10.1038/nature13138 http://dx.doi.org/10.1038/nature13138 .
CHEN A ， ZHANG V X ， ZHANG Q ， et al . Targeting the oncogenic m 6 A demethylase FTO suppresses tumourigenesis and potentiates immune response in hepatocellular carcinoma ［J］. Gut ， 2024 ， 74 （ 1 ）： 90 - 102 . DOI： 10.1136/gutjnl-2024-331903 http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2024-331903 .
RELIER S ， RIPOLL J ， GUILLORIT H ， et al . FTO-mediated cytoplasmic m 6 Am demethylation adjusts stem-like properties in colorectal cancer cell ［J］. Nat Commun ， 2021 ， 12 ： 1716 . DOI： 10.1038/s41467-021-21758-4 http://dx.doi.org/10.1038/s41467-021-21758-4 .
FEDELES B I ， SINGH V ， DELANEY J C ， et al . The AlkB family of Fe（II）/α-ketoglutarate-dependent dioxygenases： repairing nucleic acid alkylation damage and beyond ［J］. J Biol Chem ， 2015 ， 290 （ 34 ）： 20734 - 20742 . DOI： 10.1074/jbc.R115.656462 http://dx.doi.org/10.1074/jbc.R115.656462 .
JIA G F ， FU Y ， ZHAO X ， et al . N 6 -Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO ［J］. Nat Chem Biol ， 2011 ， 7 ： 885 - 887 . DOI： 10.1038/nchembio.687 http://dx.doi.org/10.1038/nchembio.687 .
WEI J B ， LIU F G ， LU Z K ， et al . Differential m 6 A， m 6 Am， and m 1 A demethylation mediated by FTO in the cell nucleus and cytoplasm ［J］. Mol Cell ， 2018 ， 71 （ 6 ）： 973 - 985.e5 . DOI： 10.1016/j.molcel.2018.08.011 http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2018.08.011 .
XU Y ， ZHOU J ， LI L ， et al . FTO-mediated autophagy promotes progression of clear cell renal cell carcinoma via regulating SIK2 mRNA stability ［J］. Int J Biol Sci ， 2022 ， 18 （ 15 ）： 5943 - 5962 . DOI： 10.7150/ijbs.77774 http://dx.doi.org/10.7150/ijbs.77774 .
HUANG Y ， SU R ， SHENG Y ， et al . Small-molecule targeting of oncogenic FTO demethylase in acute myeloid leukemia ［J］. Cancer Cell ， 2019 ， 35 （ 4 ）： 677 - 691.e10 . DOI： 10.1016/j.ccell.2019.03.006 http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2019.03.006 .
LI Z J ， WENG H Y ， SU R ， et al . FTO plays an oncogenic role in acute myeloid leukemia as a N 6 -methyladenosine RNA demethylase ［J］. Cancer Cell ， 2017 ， 31 （ 1 ）： 127 - 141 . DOI： 10.1016/j.ccell.2016.11.017 http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2016.11.017 .
XU A S ， ZHANG J S ， ZUO L P ， et al . FTO promotes multiple myeloma progression by posttranscriptional activation of HSF1 in an m 6 A-YTHDF2-dependent manner ［J］. Mol Ther ， 2022 ， 30 （ 3 ）： 1104 - 1118 . DOI： 10.1016/j.ymthe.2021.12.012 http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.12.012 .
LI R ， YAN X J ， XIAO C C ， et al . FTO deficiency in older livers exacerbates ferroptosis during ischaemia/reperfusion injury by upregulating ACSL4 and TFRC ［J］. Nat Commun ， 2024 ， 15 ： 4760 . DOI： 10.1038/s41467-024-49202-3 http://dx.doi.org/10.1038/s41467-024-49202-3 .
SINGH R ， LETAI A ， SAROSIEK K . Regulation of apoptosis in health and disease： the balancing act of BCL-2 family proteins ［J］. Nat Rev Mol Cell Biol ， 2019 ， 20 ： 175 - 193 . DOI： 10.1038/s41580-018-0089-8 http://dx.doi.org/10.1038/s41580-018-0089-8 .
VOGLER M ， HAMALI H A ， SUN X M ， et al . BCL2/BCL-XL inhibition induces apoptosis， disrupts cellular calcium homeostasis， and prevents platelet activation ［J］. Blood ， 2011 ， 117 （ 26 ）： 7145 - 7154 . DOI： 10.1182/blood-2011-03-344812 http://dx.doi.org/10.1182/blood-2011-03-344812 .
0
Views
0
下载量
0
CSCD
- L-PDFDownload
- WORDDownload
- Meta-XMLDownload
- BibTeXDownload
- EndnoteDownload
- RefMan Download
- NoteExpressDownload
- NoteFirstDownload
Publicity Resources
Related Articles
Related Author
Related Institution
- Technical support is provided by Beijing Founder electronics co., LTD 京ICP备09064830号-19
京公网安备11010802024621 - It is recommended to read the content of this site in Chrome&IE9+. Please switch to extreme mode in browser 360.
- Cookies We use cookies to help provide and enhance our service and tailor content. By continuing, you agree to the use of cookies.
